Участие нейропептидов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

С.С. Тимошин ДВГМУ, г. Хабаровск
Мое сообщение представляет из себя попытку применить концепцию Александра Михайловича Уголева об универсальных функциональных блоках (УФБ), для анализа такого многокомпонентного процесса, как участие нейропептидов в поддержании гомеостаза слизистой оболочки ЖКТ. Это клинико-экспериментальное исследование будет представлено результатами изучения трех семейств нейропептидов:

I Пептидный морфоген гидры (ПМГ)
II Семейство Ангиотензина-II
III Опиоидные пептиды
Согласно классификации Н.П. Ашмарина, нейропептиды, с определенной степенью условности можно разделить на 13 семейств. Опиоидные пептиды наиболее многочисленное семейство и именно эта группа пептидов революционизировала наши представления об интегративных системах. Кроме того, в последние годы был создан ряд фармакологических препаратов, использующихся в клинической практике. Ангиотензин-II представитель группы вазоактивных пептидов и вмешательство в метаболизм АТ-II широко осуществляется в клинической практике. Поэтому выяснение характера влияния этого нейропептида на тканевой гомеостаз имеет и прикладное значение. В этом сообщении мы не будем касаться общих представлений о надклеточных механизмах регуляции тканевого гомеостаза. Они достаточно подробно представлены в обзорах и монографиях Д.С. Саркисова и Л.И. Аруина. В то же время сведений об участии нейропептидов в этих фундаментальных работах нет.
Схема реализации внеклеточного сигнала достаточно полно изложена В.Т. Ивашкиным и удовлетворяет даже требованиям специалистов по регуляции клеточного деления. Сугубо для логичности изложения, напомним схему реализации митогенного сигнала. Информация о митогенном или антимитогенном сигнале поступает в клетку через вторичные мессенджеры, а это главным образом:

Циклические нуклеотиды
Са – кальмодулин
Инозитольные липиды
В результате происходит усиление сигнала, зачастую на два порядка – одна молекула лиганда вызывает образование до 100 молекул внутриклеточного мессенджера. Те, в свою очередь, передают сигнал на протеинкиназы, которые контролируют события клеточного цикла.
МАРК (митогенактивируемая протеинкиназа) фосфорелирует многие ферменты, которые контролируют события клеточного цикла.
РКС (протеинкиназа С) оказывает эффекты на метаболизм фосфолипидов
JAK (jast another kinase) группа киназ, через которые осуществляют свои эффекты цитомедины
Коцепция Уголева способствовала формированию представлений о том, что управление происходит не за счет специализированных регуляторных сигналов, а за счет универсальных функциональных блоков , образующих специализированные и приспособленные для определенных задач цепи. Нейропептиды в этой цепи оказались недостающим, и, в тоже время облигатным звеном, объединившим сначала нервную и эндокринную системы в нейроэндокринную. Это объединение носило характер не суммации, а революционных изменений взглядов на характер синаптической передачи. В частности, была отменена догма Дэйла – «один нейрон – один медиатор». Оказалось, что нейропептиды (первоначально это было установлено на опиоидных пептидах) способны модулировать, то есть тормозить или стимулировать работу традиционных нейротрансмиттеров.
Учитывая, что опиоиды способны модифицировать настроение и эмоции, была подведена новая база под психосоматические представления. Следующим этапом переосмысливания взаимоотношений регулирующих систем объясняющая характер взаимосвязи нервной и иммунной систем. Оказалось, что ряд нейропептидов способен оказывать непосредственное влияние на иммуноциты. На поверхности лимфоцитов были идентифицированы рецепторы к различным классам нейропептидов, более того, иммуноциты способны экспрессировать нейропептиды, взаимодействующие с нервной и эндокринной системой. Ряд цитомединов, секретируемых клетками иммунной системы, оказались лигандами рецепторов клеток эндокринной и нервной систем. Таким образом, нейропертиды «закольцовывают» нервную, эндокринную и иммунную системы и обеспечивают адекватный характер их взаимодействия. Именно НП обеспечивают построение из УФБ программ для адаптации к тем или иным изменяющимся условиям. Концепция УФБ предусматривает, что эволюция осуществляется с помощью одних пи тех же стандартных деталей. Как писал академик Крепс, «природа редко изобретает новые механизмы, и чрезвычайно широко использует механизм однажды изобретенный».
Узкая гормональная или нейропептидная специализация для типа, скорее исключение или несовершенство этапа исследований. Как сенсационное открытие характеризует Уголев тот факт, что идентифицирован общий пептидный регулятор для представителя типа Coelenterata – гидры и для млекопитающих – речь идет о пептидном морфогене гидры.
Пептидный морфоген гидры (ПМГ) или головной активатор гидры является облигатным фактором для полноценной регенерации гидры. Впервые он был выделен из нейросекреторных клеток у представителей типа кишечнополостных. Примечательно, что для получения 1мг ПМГ потребовалось 200 кг (!) Anthrophleus eleganissima. ПМГ оказался ундекапептидом с формулой pGlu-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Leu-Phe. .Вскоре ПМГ был идентифицирован цитохимическими методами у ряда млекопитающих, в том числе у человека. В 1981 Шаллер и Боденмюллер осуществили синтез ПМГ(17,19). В лаборатории синтеза пептидов кардиоцентра РАМН был наряду с ПМГ синтезирован его аргининовый аналог а также 5N концевой фрагмент, оцениваемый как функциональный анатагонист молекулы ПМГ. У пердставителей типа Coelenterata ПМГ играет роль универсального фактора роста (18, 20). Физиологическое значение этого ундекапептида у млекопитающих в настоящее время всесторонне изучается. ПМГ продуцируется нервными и эндокринными клетками (2, 22) наиболее высокая концентрация нейропептида выявленыа в гипоталямусе и поджелудочной железе а также в кишечнике. Концентрация его в плазме составляет 20 – 100 фМ/мл по данным Winnikes et al. (1992) у больных с опухолями головного мозга имеет место тысячекратное увеличение концентрации ПМГ в плазме. Кроме того, многократное увеличение содержание ПМГ в плазме происходит при ряде новообразованиий ЖКТ (21) Повышение уровня ПМГ в плазме крови и спиномозговой жидкости наблюдается у больных с тяжелыми формами гнойного менингита(13). Эволюционная стабильность ПМГ, его важная роль в процессах морфогенеза и регенерации у кишечнополостных, высокая концентрация пептида в нормальных и опухолевых тканях, послужили основанием для изучения роли ПМГ в поддержании тканевого гомеостаза млекопитающих. Исследования, выполненные в нашей лаборатории, свидетельствуют, что однократное и пятикратное введение ПМГ крысам в дозе 10 или 100 мкг/кг активирует процессы синтеза ДНК в различных клеточных популяциях, в том числе, в пилорическом отделе желудка. Напротив, функциональный антагонист ПМГ

– 5N фрагмент, индуцировал у крыс достоверное уменьшение количества ДНК-синтезирующих ядер в различных клеточных популяциях, в том числе, в эпителиоцитах пилорического отдела желудка (16). Введение ПМГ приводит к снижению содержания цАМФ в ткани желудка, особенно в первые часы после введения препарата. По-видимому, митогенный эффект ПМГ частично реализуется через его способность оказывать воздействие на Na/H обмен (14). ПМГ стимулирует синтез ДНК и при непосредственном воздействии на клетку. В тоже время, в реализации его пролиферативных эффектов, существенная роль принадлежит способности создавать гормональный контекст, активирующий процессы клеточного деления. При введении ПМГ в дозе 100 мкг/кг, в плазме крови повышается концентрация гормонов – индукторов синтеза ДНК- Т3, Т4, инсулина, бетта-эндорфина (8). Модулирующий характер влияния ПМГ на процессы синтеза ДНК эпителиоцитов желудка особенно отчетливо проявляется в условиях стресса:



(Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
4-х часовая иммобилизация крыс привела к увеличению концентрации кортикостерона в крови в 1,6 раза, достоверному снижению массы тимуса. Кроме того, наблюдалось более чем двукратное уменьшения содержания ТТГ и резкое падение концентрации Т4.
Об активации перекисного окисления липидов свидетельствовало более чем трехкратное увеличение содержания малонового диальдегида и гидроперекиси липидов. При этом более чем в три раза снижалось содержание альфа-токоферрола.

(Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Достоверное снижение ИМЯ эпителиоцитов пилорического отдела желудка имело место сразу и через 24 часа после окончания иммобилизации. Предварительное введение ПМГ предотвратило сдвиги эндокринного баланса сразу после окончания 4-х часовой иммобилизации, кроме того, в основном нормализовались показатели процессов ПОЛ. Масса тимуса на 24-х часовом сроке исследования не отличалась от показателей интактного контроля. Предварительное введение ПМГ несколько ослабило угнетение синтеза ДНК сразу после окончания иммобилизации, и привело к нормализации синтеза ДНК эпителиоцитов через 24 часа после окончания фиксации. По-видимому, способность ПМГ поддерживать тканевой гомеостаз при стрессе складывается из нескольких взаимосвязанных механизмов. В определенной степени это относится к способности ПМГ при непосредственном взаимодействии с клеткой стимулировать синтез ДНК (15, 16). Другим фактором является свойство ПМГ создавать эндокринный баланс, оптимизирующий процессы пролиферации (8). Определенный вклад в способность ПМГ поддерживать тканевой гомеостаз в слизистой оболочке желудка вносит иммуномодулирующая активность пептида (9). Важным механизмом действия ПМГ является его способность активировать ферментативное и неферментативное звено антиоксидантной защиты (5,6). Так, за счет взаимодействия ПМГ с УФБ клеток различного генеза, формируется специализированная программа, направленная для оптимального течения процессов регенерации.
В отличие от ПМГ, физиологическая роль ангиотензина второго (АТ-II) достаточно хорошо изучена. Согласно современным представлениям, этому пептиду отводится ведущая роль в патогенезе артериальной гипертензии. Исследования последних лет свидетельствуют, что АТ-II, наряду со способностью регулировать артериальное давление и поддерживать электролитный гомеостаз, обладает свойствами классического фактора роста. Первоначально АТ-II рассматривался, главным образом, как фактор ангиогенеза и стимуляции пролиферативных процессов гладкой мускулатуры сосудов. Дальнейшие исследования выявили его способность активировать синтез ДНК астроглиальных клеток, маммотрофов передней доли гипофиза, остеобластов свода черепа и фибробластов кожи человека. В наших исследованиях был продемонстрирован митогенный эффект АТ-II в клеточных популяциях, в том числе в 12-перстной кишке новорожденных крыс (3,4). Аналогичный эффект имел место у половозрелых животных. Однократное и пятикратное введение АТ-II в дозе 100мкг/кг половозрелым крысам-самцам также активировало процессы синтеза ДНК эпителиоцитов пилорического отдела желудка и 12-перстной кишки. Об этом свидетельствует достоверное увеличение ИМЯ в 1,2 – 1,5 раза, при этом наряду с увеличением количества ДНК-синтезирующих ядер, возрастала скорость синтеза ДНК: ИМ достоверно увеличивалась в 1,4 раза.

Введение АТ-II вызывает в организме широкий спектр физиологических реакций, каскадные эффекты, которые могут оказать воздействие на пролиферативные процессы. Для доказательства вовлеченности АТ-II в размножение эпителиоцитов желудкка и 12-перстной кишки, были проведены опыты, направленные на блокаду эндогенного АТ-II. С этой целью животным с помощью зонда вводили 10 мкг/кг блокатор рецепторов АТ-II козаар (“Merk”) или ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эднит (Gedeon Richter). Указанные дозы наиболее часто используются для блокады АТ-II у крыс. В качестве контроля были использованы две группы животных: интактные и получавшие с помощью зонда изотонический раствор поваренной соли. Манипуляции с животными при введении

(Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
изотонического раствора индуцировали у крыс достоверное увеличение ИМЯ в эпителиоцитах 12-перстной кишки и тенденцию к активации синтеза ДНК в пилорическом отделе желудка. Введение эднита и козаара привело к уменьшению ИМЯ по сравнению с таковым у крыс, которым с помощью зонда вводили изотонический раствор поваренной соли. В тоже время, достоверных отличий по сравнению с интактным контролем не наблюдалось. Фактически имела место нормаоизация клеточного деления эпителиоцитов слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки.

(Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Ингибиторы АПФ являются средством базовой терапии у больных с артериальной гипертонией. Учитывая тот факт, что это заболевание чрезвычайно часто сочетается с хеликобактерными гастритами, при которых имеют место гиперрегенераторные процессы, представляло интерес изучить характер влияния терапии эналоприлом (эднит) суточная доза от 2,5 до 15 мг и лизиноприлом (диротон) в суточной дозе 5 – 10 мг, на течение гастродуоденальной патологии. Эти исследования выполнялись нами совместно с проф. С.А. Алексеенко. Комплексное обследование больных до и после 3-х месячного курса лечения включало оценку клинической симптоматики, суточный мониторинг АД с помощью аппарата АВРМ-04 (Венгрия), эндоскопию верхних отделов ЖКТ,определение НР – инфекции, пролиферацию эпителия слизистой оболочки желудка (по Ki-67 антигену). Через 3 месяца после лечения частота проявлений диспептических симптомов уменьшилась с 78,2% до 40%. Положительная динамика состояния гастродуоденальной слизистой оболочки, по данным эндоскопических исследования, наблюдалась у 45,5%. Индекс меченых ядер эпителиоцитов фундального отдела желудка достоверно снизился с 24,3% до 16,5% .
Семейство опиоидных пептидов, самое многочисленное из всех нейропептидов. История идентификации опиоидных пептидов - убедительная иллюстрация дедуктивного подхода к исследованиям. Целенаправленный поиск эндогенных регуляторов (в данном случае, аналгезирующих веществ) оказался успешным и революционизировал молекулярную биологию и физиологию. Именно расшифровка структуры эндорфинов и энкефалинов, осуществленная Хьюсом и Костерлицем послужила основой предположения о том, что биологическая активность нейропептидов выходит за рамки нервной системы и включает в сферу своей деятельности и эндокринную, и иммунную системы.
Геном человека содержит по крайней мере 3 гена, кодирующих высокомолекулярные предшественники опиоидных пептидов. К настоящему времени в организме человека и высших животных обнаружено около 30 олигопептидов, обладающих опиоидной активностью. Эндогенные опиоидные пептиды подразделяются на четыре класса:

Эндорфины.
Энкефалины.
Динорфины.
Дерморфины.
Количество различных синтетических аналогов эндогенных опиоидов исчисляются сотнями. Биологической активности опиоидов посвящаются ежегодные симпозиумы. Общие представления об их свойствах изложены, в частности, в монографиях (7,10).
Синтетический аналог лей-энкефалина - даларгин , созданный в лаборатории синтеза пептидов кардиологического центра РАМН, является фармакологическим препаратом. При изложении этой части исследования мы сделаем акцент на результатах клинического применения препарата. В то же
Рис.5. Влияние различных доз даларгина на синтез ДНК.




 
 
(Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
время необходимо привести некоторые данные исследований, выполненных на лабораторных животных. Даларгин также, как и бетта-эндорфин, синтетический аналог лей-энкефалина - ДАДЛ, аналог дерморфина - седатин, оказывают стимулирующее влияние на процессы синтеза ДНК в различных клеточных популяциях, в том числе и в клетках желудочно-кишечного тракта. Этот эффект опосредуется через дельта-рецепторы и отменяется антагонистом опиоидных рецепторов - даларгином. Стимуляция синтеза ДНК под влиянием опиоидов имеет место и в культуре клеток.
Наряду с непосредственным митогенным эффектом на клетку, опиоиды, как и ПМГ, создают в организме эндокринный фон, способствующий оптимальному течению процессов клеточного деления. Особо следует отметить способность опиоидов стимулировать клеточное деление в чрезвычайно низких дозах. Основная часть исследований была проведена нами при использовании дозы пептидов 10-100 мкг/кг. Представленные на графике данные свидетельствуют, что даларгин способен активировать синтез ДНК в широком диапазоне доз: от 0,1 мкг/кг до 100 мкг/кг. Для сравнения отметим, что способность глюкокортикоидных гормонов оказывать ингибирующее действие на синтез ДНК реализуется в дозах на 4-5 порядков превышающих используемые в наших опытах.
Способность синтетического аналога лей-энкефалина - даларгина - стимулировать синтез ДНК является одним из основных механизмов его эффективности при лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (1, 11). В наших исследованиях даларгин особенно активно увеличивал количество ДНК-синтезирующих ядер в крае язвы (рис.6.).

(Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Сочетанное применение даларгина и Н2 -блокаторов способствует более эффективному восстановлению тканевого гомеостаза. У детей, которым проводилась сочетанная терапия, наряду с улучшением клинической симптоматики, имело место уменьшение воспалительной и гиперрегенераторной реакции.
Следует отметить, что физиологические эффекты даларгина шире тех, которые имеют место при действии других опиоидных пептидов, близких даларгину по характеру взаимодействия с субпопуляциями опиоидных рецепторов. Одно из возможных объяснений этому мы видим в том, что кроме взаимодействия с опиоидными рецепторами, даларгин может являться донатором аргинина. Аргинин - важнейший индуктор оксида азота. Напомним, что при эрозиях и язвах желудка и двенадцатиперстной кишки способность слизистой генерировать оксид азота ослаблена. Иммунномодулирующий эффект даларгина также может быть связан со способностью пептида выступать в роли донатора аргинина.
Модулирующий характер реакции процессов синтеза ДНК в эпителиоцитах желудка в ответ на введение даларгина ,также имевший место при введении ПМГ, объясняется гомеостатическим характером исследуемого процесса.
Как можно объяснить, что нейропептиды, выполняющие в организме специфические физиологические функции, вовлечены в регуляцию процессов синтеза ДНК в различных клеточных популяциях? А.М. Уголев приводит пример тому, как одноклеточные организмы с помощью экстрацеллюлярной цАМФ обмениваются информацией (о голоде или тревоге), которая в свою очередь оказывает влияние на процессы клеточного деления.
По-видимому, при формировании многоклеточных организмов сигнальные молекулы, древнейшими из которых являются нейропептиды, передавая информацию о тех или иных процессах, вовлекались в регуляцию клеточного деления.
В журнале Drug News Perspectives, N9 (2000) K.Oliver высказывает предположение, что в ближайшее время произойдет активный переход от фундаментальных исследований нейропептидов к созданию на их основе новых классов лекарств.
Литература

Алексенко С.А., Тимошин С.С. Влияние блокаторов Н2- рецепторов гистамина и даларгина на репаративные процессы в слизистой оболочке гастродуоденальной системы у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки // Клиническая медицина.- 1996.- № 9.- С. 52-53.
Вараксин А.А., Виноградов В.А., Мотавкин П.А.. Зверков И.В., Тищенко В.А. Локалазация пептидного «морфоген гидры» в нейронах моста головного мозга человека// Архив анатомии, гистологии, эмбриологии.- 1987.- Т. 93, N 9.- с. 34-36.
Животова Е.Ю. Влияние ангиотензина II на синтез ДНК в различных клеточных популяциях белых крыс. Автореферат. к.м.н.. Владивосток 2001, 16 с.
Животова Е.Ю., Тимошин С.С. Влияние ангниотензина II на синтез ДНК в миокарде и эпителиальных тканях новорожденных белых крыс //БЭБИМ.-1998.-Т. 126, N 2. .-C.643-645.
Лебедько О.А., Тимошин С.С. Влияние пренатальной гипоксии на синтез ДНК в эпителии трахеи и систему ПОЛ-АОЗ в легких новорожденных крысят// БЭБИМ.-1994.-N 5.-C.531-533.
Лебедько О.А., Тимошин С.С. Применение неопиатного аналога лей-энкефалина и пептидного морфогена гидры для коррекции нарушений пролиферации в эпителии трахеи и процессов ПОЛ в легких новорожденных крыс, подвергнутых пренатальной гипоксии//БЭБИМ.-1994.-N 5.-C.535-537.
Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н. Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. -Томск, 1994.- 352 с.
Мурзина Н.Б., Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., Обухова П.П.. Аносова О.А., Березина Г.П.. Влияние пептидного морфогена гидры на уровень бета-эндорфина и некоторых гормонов крови и надпочечников белых крыс// БЭБИМ.- 1991.- Т.112., N 10.- С. 433-435.
Порядин Г.В., Салмаси Ж..М., Казимирский А.Н.. Макарков А.И., Бозиева Н.И. Изучение влияния медиаторов тканевого повреждения на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами человека in vitro// БЭБИМ.-1995.-2.-196-198.
Смагин В.Г., Виноградов В.В., Булгаков С.А. Лиганды опиатных рецепторов.
М.: изд-во "Наука", 1983.- 270 с.
Тимошин С.С., Алексеенко С.А., Штука А.А. Влияние даларгина на репаративную способность гастродуоденальной слизистой оболочки у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки // Клиническая медицина.- 1991.- № 3.- с, 75-77.
Тимошин С.С., Животова Е.Ю. Участие компонентов системы ангиотензина II в регуляции синтеза ДНК в эпителии пилорическогго отдела желудка белых крыс
//БЭБИМ.-2000.-Т. 129, N 2. .- C.214-216.
Трясучева И.Г., Милосердов Ю.В., Тищенко В.А., Виноградов В.А.
Динамика пептидного морфогена гидры при менингите// Тер. архив.-1990.- Т. 62., N 2.- с. 104-106.
Хомичук А.Ю., Тимошин С.С. Орлов С.Н., Покудин И.И., Кубатиев А.А. Пептидный морфоген гидры активирует Na/Н-обмен в эритроцитах человека// БЭБИМ.- 1991.- Т.111., N 6.- С. 586-587.
 Хомичук А.Ю., Тимошин С.С. Влияние ундекапептида морфогена гидры на процессы клеточного деления в эпителии роговицы и языка белых крыс// БЭБИМ.- 1990.- Т.110., N 10.- С. 425-427.
Хомичук А.Ю., Тимошин С.С. Участие пептидного морфогена гидры в регуляции процессов пролиферации различных тканей белых крыс // БЭБИМ.- 1991.- Т.112., N 9.- С. 307-309.
Bodenmuller H., Schaller H.C. Conserved amino acid sequens of a neuropeptide, the head activator, from coelenterates to humans