Окись азота в регуляции функций желудочно-кишечного тракта.(часть 1)

С.А.Поленов
Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, С-Петербург

Окись азота (NO) представляет собой простую и маленькую молекулу газа,обладающую, однако, высокой химической реактивностью по причине ее свободно-радикальной структуры. Период полужизни NO в живых организмах составляет от 2 до 50с из-за быстрого окисления до двуокиси азота (NO2), которая в водных растворах также быстро превращается в нитрит (NO2-) или нитрат (NO3-). В свою очередь,нитриты могут генерировать NO при ацидификации, что происходит, например, в полости желудка. NO также быстро разрушается супероксидом (O2-) с образованием нитрата, поэтому супероксиддисмутаза защищает NO от разрушения этим анионом. Недавно стало ясно, однако, что продуктом реакции между этими двумя свободными радикалами может являться пероксинитрит (ONOO-)- важнейший фактор цитотоксичности. При этом скорость его образования зависит от концентрации NO и супероксида таким образом, что при увеличении последних в 10 раз, продукция пероксинитрита возрастет в 100 раз (Beckman, Tsai, 1994). Эти данные позволили приступить к разработке одной из важнейших проблем в биологии NO, а именно понять, каким образом и при каких обстоятельствах одна и та же молекула способна оказывать и физиологические и патологические эффекты. Прекращение биологической активности NO в организме происходит также путем связывания NO с гемоглобином и другими железосодержащими белками.

В настоящее время NO рассматривается как первый представитель нового класса сигнальных молекул, осуществляющих межклеточную коммуникацию и регуляцию множества функций в разных тканях и системах организма. Исследования по NO были настолько впечатляющими, что в 1992 г. в журнале Science эта молекула была названа молекулой года(Koshland, 1992), что усилило интерес к ее всестороннему исследованию. Об огромном интересе к этой проблеме свидетельствует и стремительный рост числа публикаций. В базе данных Medline, которая широко охватывает биологическую научную литературу, на компакт диске за 1993г. приведено 1866 источников, касающихся разных аспектов изучения NO, в 1994г. - 2979 источников, а в 1995г. число публикаций достигло почти 5000.

В клинической практике доноры NO применяются уже давно, например, нитроглицерин при ишемии сердца, поэтому день рождения этой области исследования определить затруднительно. Новая история NO началась в 1980г. когда американские исследователи Furchgott и Zawadski обнаружили, что известное вазодилататорное вещество - ацетилхолин - вызывает сокращение колечек из аорты кролика, если эндотелий был поврежден или удален, действуя при этом прямо на М-холинорецепторы гладких мышц сосуда. И только при интактном эндотелии ацетилхолин вызывал расслабление сосудов, что было связано с выделением из эндотелия нестабильного, высоко липофильного вещества, которое было названо “фактор расслабления эндотелиального происхождения” (endothelium - derived relaxing factor, EDRF). В конце 80-х годов независимо Furchgott и Ignarro с соавторами предположили, что таким фактором может служить NO, а Moncada с соавторами показал, что NO в эндотелиальных клетках образуется энзиматически из L- аргинина (см. ссылки в обзорах: Moncada et al., 1991; Griffith, 1994).

В настоящее время хорошо установлено, что основным субстратом NO в организме является L - аргинин, из которого NO синтезируется ферментом NO-cинтазой (NOS) c участием кислорода и кофактора NADPH, а также ионов кальция. В результате этой реакции образуется также L-цитруллин, который в эндотелиальных клетках быстро вновь превращается в аргинин, что поддерживает его концентрацию (именно в эндотелиальных клетках) на достаточном уровне. Аргинин относится к полунезаменимым аминокислотам и недостаток его могут испытывать молодые субъекты. Синтез аргинина de novo осуществляется кооперативно эндотелиальными клетками кишечника и почками. В кишечнике цитруллин является промежуточным звеном в реакциях орнитинового цикла и образуется также из глутамата, далее с током крови поступает в почки, где происходит синтез аргинина, который служит субстратом для синтеза NO во многих тканях (S. Konturek, P. Konturek, 1995).

Стимулами для синтеза NO в эндотелиальных клетках служат сдвиговые усилия (поток крови), пульсовые колебания давления, а также ацетилхолин, аденозиндифосфат, брадикинин, субстанция Р, кальцитонин-ген родственный пептид и другие агенты, повышающие уровень цитозольного кальция, что содействует реакции, и активирующие NOS. Образуемая при этом NO может действовать в самой клетке, либо достигает клеток- мишеней путем простой диффузии. В любом случае внутриклеточной мишенью для NO является растворимая гуанилатциклаза, которая стимулирует образование цГМФ, являющегося для NO главным внутриклеточным вторичным мессенджером (ссылки в обзорах: Moncada et al.1991, Х.М.Марков, 1996). Следствием этого в кровеносных сосудах будет расслабление гладких мышц, снижение агрегации тромбоцитов, уменьшение адгезии лейкоцитов. Понятен поэтому тот большой интерес, который проявляется к выяснению роли NO в механизмах гипо- и гипертензии, атеросклероза, тромбоза, последствий ишемии/реперфузии, а также поиску путей коррекции как недостатка, так и избытка продукции NO с целью изыскания новых средств фармакотерапии ( Porsti, Paakkari, 1995).

Сейчас известны три типа NO- синтазы (NOS), обычно обозначаемые как тип 1 - нейрональная (nNOS), тип 2 - макрофагальная (iNOS или mNOS), и тип 3 - эндотелиальная (eNOS). Описаны две формы NOS: конститутивная (cNOS), которая является кальций - кальмодуллин - зависимой и индуцируемая (iNOS), действие которой не зависит от кальций - кальмодуллиновой системы. Считается, что нейрональная NOS является только конститутивной, она может быть спонтанно активна, обеспечивая некоторый базальный уровень секреции NO, либо быстро активироваться в ответ на нервный импульс.

Макрофагальная NOS является только индуцируемой, для ее активации требуются часы и действие таких факторов как эндотоксины, цитокины, бактериальные липополисахариды, после чего макрофаги, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, микроглиальные клетки, астроциты, содержащие эту форму NOS, продуцируют NO длительно и в больших количествах. Эндотелиальная NOS на 80% относится к конститутивной форме и примерно на 20% к индуцируемой.

Таб. 1
Удачным инструментом для изучения роли NO в физиологических исследованиях является применение ингибиторов NOS, которые угнетают секрецию NO. В Табл.1 приведены некоторые из них, а также указан эндогенный ингибитор NOS, обнаруженный сравнительно недавно (Vallance et al., 1992). Его уровень повышается в плазме крови при почечной недостаточности (что может частично объяснять развитие почечной гипертензии), а также при геморрагическом шоке, что может иметь защитное значение против гипотензии. Неселективные ингибиторы NOS представляют собой те или иные аналоги L-аргинина, у которых заменены один или оба терминальных гуанидиновых атома азота, и вероятный механизм их действия заключается в конкурентном ингибировании, то есть они служат как ложные субстраты вместо L-аргинина (Porsti, Paakkari, 1995). Большие усилия были направлены на поиски селективных ингибиторов NOS, и такие теперь найдены для индуцироемой и нейрональной NOS (Табл. 1). Следует отметить, что действие разных синтетических ингибиторов NOS сильно различается по эффективности, а также в разных тканях и при применении разных стимулов; кроме того, в больших дозах они могут угнетать мускариновые рецепторы и влиять на циклооксигеназу (Porsti, Paakkari, 1995), что требует осторожности в интерпретации экспериментальных данных.

Табл.2
Методически наличие и активность NO системы в тканях определяется иммунохимическим методом с помощью антисывороток к NOS, гистохимически по NADPH- диафорезу, а также по продукции цитруллина и NO- сенсорами, точность которых достигает 1 нM ( судя по рекламным проспектам ). С помощью этих методов NOS была обнаружена во многих тканях ЖКТ и показано, что источником NO в ЖКТ служат эпителий , сосудистый эндотелий, гладкие мышцы, тучные клетки, резидентные и инфильтративные лейкоциты (нейтрофилы и макрофаги), энтеральные нейроны (Salzman, 1995).

Некоторые выборочные сведения о распределении NOS в энтеральной нервной системе предоставлены в Табл. 2. Они свидетельствуют о большой распространенности NOS в энтеральных нейронах в разных отделах ЖКТ у лабораторных животных и человека, а также о сосуществовании NOS с пептидными и классическими ко- трансмиттерами, в том числе и в вегетативных нервах , снабжающих ЖКТ. Все это обеспечивает базу для возможного участия NO в механизмах нервной регуляции функций ЖКТ как через энтеральную нервную систему, так и вегетативную иннервацию.

Представления о NO как нейротрансмиттере проанализированы в двух недавних крупных обзорах ( Х.М.Марков,1996; Lundberg, 1996). Действительно NO не удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к классическим и пептидергическим нейромедиаторам, а именно, NO не хранится в везикулах, не имеет специфических рецепторов, и, будучи свободно-радикальной молекулой газа, достигает своих мишеней путем простой диффузии. Однако NO присущи пять важных свойств, характеризующих нейротрансмиттеры 1) наличие в нейронах специфического субстрата и синтезирующего фермента,(2) способность высвобождаться из терминалей в ответ на нервные импульсы, (3) способность воспроизводить эффект нервной стимуляции, (4) возможность блокирования эффекта нервной стимуляции путем блокады синтезирующего NO фермента, (5) наличие механизмов деградации ( инактивации) NO за счет супероксида и гемоглобина. По этим причинам выдвинутая ранее концепция об NO как первом представителе нового класса нейротрансмиттеров (Snyder, 1992) сейчас, кажется, получила широкое признание.

Если первоначально в 80-е годы почти в течение десятилетия исследования, связанные с NO, были преимущественно посвящены сердечно-сосудистой системе, то в 90-х годах мощный рост числа таких исследований коснулся едва ли не всех функциональных систем, включая и ЖКТ. Ниже будет представлен анализ небольшого числа работ, субъективно выбранных из множества опубликованных и касающихся роли NO в регуляции функций верхних отделов ЖКТ, преимущественно желудка. При этом следует оговориться о трудностях анализа конкретных механизмов действия NO ввиду сложных взаимоотношений NO и множества других регуляторных систем. Кроме того, в прижизненных физиологических экспериментах архисложно установить конкретный источник синтеза NO будь то нейроны, эндотелий, эпителий или гладкие мышцы и пр.

Роль NO в регуляции желудочной секреции бикарбонатов исследована на крысах группой Takeuchi. Авторы показали что ингибитор NOS L-NAME дозозависимо увеличивал секрецию бикарбоната, из чего вытекает, что в желудке крыс имеется базальная секреция NO, оказывающая в покое тоническое угнетающее влияние на секрецию бикарбоната (Takeuchi et al., 1993). Далее в этой же работе было показано, что введение субстрата NO( L- аргинин) или донора NO (нитропруссид) ослабляло стимулирующий эффект L-NAME, уменьшая при этом секрецию бикарбоната, что подтверждает угнетающее действие NO. Затем авторы установили, что такое же уменьшение секреции бикарбоната или ослабление стимулирующего эффекта L-NAME достигалось раздельно ваготомией, атропином, либо индометацином. Следовательно, эффект угнетения биосинтеза NO, проявляющийся в усилении секреции бикарбоната, частично зависит от вагусной холинергической иннервации, частично опосредуется эндогенными простагландинами. Практически сходные результаты были получены авторами в другой работе, выполненной на двенадцатиперстной кишке крысы по той же методологии и были сделаны аналогичные выводы ( Takeuchi et al., 1995). Однако на увеличение желудочной секреции бикарбоната, вызванное внутрижелудочным введением повреждающих концентраций солевого раствора, L-NAME влияния не оказало (Takeuchi et al., 1994), свидетельствуя о том, что при данном воздействии увеличение секреции бикарбоната объясняется иными механизмами (без участия NO).

На изолированных главных клетках свиньи увеличение секреции пепсиногена в ответ на лейкотриены В-4, С-4, D-4 и Е-4 угнеталось на 50-60% при введении L-NMMA, следовательно, стимулирующий эффект лейкотриенов частично опосредован релизингом NO (Fiorucci et al., 1995). Эти авторы в другой своей работе (Fiorucci et al., 1996) показали, что и эптдермальный фактор роста увеличивает секрецию пепсиногена частично за счет генерации NO.

В отношении желудочной секреции кислоты у крыс было показано, что NO опосредует интерлейкиновое угнетение кислой секреции, стимулированной пентагастрином (Esplugues et al.,1993), но не влияет на центральную вагусную активацию секреции кислоты (Tanaka et al.,1993). Показано также, что угнетение кислой секреции в ответ на внутрижелудочное введение гипертонического солевого раствора опосредовано синтезом NO, а NO донор - нитропруссид угнетает гистаминовую секрецию кислоты (Takeuchi et al., 1994). Последнее позволяет предположить возможность NO- механизма обратной связи, cпособного ограничивать гиперсекрецию кислоты, по крайней мере, в случае гистаминовой стимуляции. В целом, однако, данные о влиянии NO на реактивность кислотопродуцирующих клеток к различным секретогогам не отличаются достаточной четкостью, чтобы можно было формулировать сейчас определенные выводы, то же относится к роли NO в регуляции секреции пепсиногена.

Исследованиям роли NO в регуляции моторики ЖКТ посвящено, кажется, больше публикаций, чем другим функциям. На толстом кишечнике морской свинки показано, что релаксация, вызываемая серотонином, опосредована синтезом NO; при действии больших доз АТФ релаксация частично опосредована NO, релаксация на малые дозы АТФ, как и на вазоактивный интестинальный полипептид (ВИП), вообще не связана с NO (Briejer et al.,1995).

В ряде сообщений на 15-м международном симпозиуме по регуляции моторики в ЖКТ (International symposium …, 1995) было показано, что NO является главным ингибиторным медиатором, определяющим расслабление сфинктера Одди, анального сфинктера , тонкого и толстого кишечника, пищевода и желудка.
В тонком кишечнике птиц АТФ вызванная релаксация опосредована кооперативным действием NO и ВИП, а холецистокининовая релаксация связана с секрецией АТФ, который в свою очередь стимулирует синтез и секрецию NO и ВИП (International symposium …, 1995), то есть оказывает с ними кооперативное действие. В тонком кишечнике крысы ингибитор NOS L-NAME увеличивал тонус и фазические сокращения, что свидетельствует о существовании тонических угнетающих влияний NO на моторику кишки (Hillsley, Grundy, 1994). Сходные данные получены на толстом кишечнике мыши, где ингибитор NOS L-NNA увеличивал частоту ММК на 400%, а также и исходный тонус (International symposium …, 1995).На основании этих и ряда других работ ( см. обзор S.Konturek, P.Konturek,1995) можно заключить в целом, что, во первых, “спонтанная” секреция NO оказывает непрерывное угнетающее влияние на тонус и перистальтику кишечника в состоянии физиологического покоя, во вторых, NO может служить посредником релаксирующего действия ряда, но не всех биологически активных веществ, и, в третьих, предполагается, что NO может участвовать в нейрогенном неадренергическом нехолинергическом расслаблении гладких мышц кишечника. Термин “спонтанная” секреция здесь, в отличие от других публикаций, был взят в кавычки, ибо едва ли он окажется достаточно точным. Как и в случае с базальной или фоновой продукцией NO сосудистым эндотелием, которая, как теперь ясно, не является “спонтанной”, а инициируется потоковыми усилиями сдвига и пульсовыми толчками, так и в кишечнике могут быть найдены стимулы, вызывающие эту “спонтанную” секрецию; ими могут оказаться, например, сами перистальтические волны или определенные нервные импульсные сигналы.

Ряд интересных исследований был выполнен с изучением роли NO в регуляции моторики пищевода, в том числе у человека. В частности было показано, что введение донора NO молсидамина уменьшает базальное давление в нижнем пищеводном сфинктере (Wills et al., 1994). И хотя эти данные получены на здоровых добровольцах, авторы считают перспективным применение этого препарата при нарушениях моторики пищевода. У больных с диффузным спазмом пищевода был продемонстрирован благоприятный эффект введения больших доз нитроглицерина (100-200 мкг/кг/час, в/в), что восстанавливало нормальные перистальтические сокращения пищевода , применение NO субстрата L- аргинина в этих случаях оказалось неэффективным (Konturek et al., 1995). Авторы подчеркивают перспективность применения нитроглицерина у таких больных, полагая, что заболевание связано с нарушением синтеза и (или) деградации
эндогенной NO. Небезинтересно здесь будет отметить, что у крыс, в отличие от других видов, расслабление нижнего пищеводного сфинктера не опосредовано NO (International symposium …, 1995), однако, в слизистой пищевода и эндотелии подслизистых вен у крыс при экспериментальной портальной гипертензии наблюдается резкое увеличение как cNOS, так и iNOS и РНК (в 10 и 20 раз соответственно) (Tanoue et al., 1996). В отличие от крысы, у морской свинки в нижнем пищеводном сфинктере 53% местных (энтеральных) ингибиторных мотонейронов NOS-иммунореактивны, а нисходящие ингибиторные мотонейроны в 86% содержат NOS (Brookes et al., 1996), свидетельствуя о высокой NO-иннервации сфинктера.

Табл.3
Вопрос о роли NO в механизмах релаксации желудка привлекает особый интерес по причине важности и давности этой нерешенной проблемы. Термин рецептивная релаксация, введенный в начале века, означает расслабление желудка в момент прохождения пищи по пищеводу; термин адаптивная релаксация, или аккомодация, подразумевает расслабление желудка в момент поступления в него пищи. Известно, что обе эти реакции являются рефлекторными и опосредуются блуждающими нервами, однако, не являются при этом ни холинергическими, ни адренергическими. Именно благодаря этим исследованиям термин “ не -холинергическая не - адренергическая иннервация” был введен в литературу. На протяжении 80 лет исследований этой проблемы было предложено много гипотез, объясняющих механизмы этих феноменов с большим или меньшим, но временным
успехом, пока на наступила эра NO. В табл.3 представлены некоторые результаты исследований последних лет, из которых вытекает , например, что релаксация желудка на пентагастрин протекает без участия NO, а дуаденогастральный механизм релаксации связан с продукцией NO. Установлено также, что доноры NO расслабляют желудок, а ингибиторы NOS увеличивают его тонус. Это доказывает, во-первых, релаксирующее действие NO на гладкие мышцы желудка, а во-вторых, наличие некоторой базальной секреции NO, оказывающей непрерывное угнетающее влияние на тонус желудка. Далее в таблице приводится ряд работ, в которых показано, что расслабление желудка в ответ на стимуляцию регионарных нервов, включая симпатические и парасимпатические, предотвращается ингибиторами NOS, что и доказывает достаточно убедительно гипотезу об NO как медиаторе нейрогенного неадренергического нехолинергического расслабления желудка.

Таких данных накопилось сейчас достаточно много, их хватило бы не на один десяток подобных таблиц. Обращает на себя внимание только тот факт, что в большинстве исследований с электрической стимуляцией нервов, как и в приведенных выше в табл.3, как правило, применялся атропин. В принципе таких исследований было проведено множество и ранее, новизна современных заключается только в выявлении роли NO c помощью ингтбиторов NOS или субстрата NO. Возникает вопрос, каким образом реализуется эта нейрогенная NO- опосредованная релаксация желудка в естественных условиях, т.е. без атропина, ибо аналога М-холиноблокатора в организме не синтезируется.

Не останавливаясь на подробном анализе этого вопроса, отметим лишь, что до последнего времени в исследованиях со стимуляцией вегетативных нервов применялся в основном регулярный непрерывный тип активации с той или иной частотой (обычно от 1 до 10 гц), что не соответствует естественному паттерну нервной импульсной активности. Прямые электрофизиологические данные свидетельствуют, что импульсная активность в вегетативных нервах носит нерегулярный и чаще пачечный (или залповый) характер, с разным числом импульсов в пачке, с разным расстоянием между пачками (3 - 8 с) и с разной длительностью пачек ( 1 - 3 с), а внутрипачечная частота может достигать 35 и даже 45 гц. Когда мы в опытах на крысах сопоставили эффекты регулярной и пачечной стимуляции эфферентных волокон блуждающих нервов поддиафрагмально (Polenov et al., 1995), то оказалось, что стимуляция пачками импульсов с длительностью пачки 1 мс, межпачечного интервала 4 с при внутрипачечной частоте 20 или 40 имп/с вызывала закономерную релаксацию желудка у животных без атропинизации. Наоборот регулярная стимуляция с частотой 4 или 8имп/с, обеспечивающая то же самое общее число импульсов за одинаковый период стимуляции (т.е., 240 и 480 имп. за 1 мин. при сопоставимых частотах), вызывала закономерное увеличение тонуса желудка. После атропинизации характер реакций на регулярную стимуляцию изменился, при частоте 4 и 8 имп/с наблюдалась выраженная частото-зависимая релаксация желудка, которая, тем не менее, была существенно слабее, чем при сопоставимых частотах (20 и 40 гц) пачечного паттерна стимуляции. В другой серии опытов (неопубликованные данные) был применен ингибитор NOS L-NAME (40 мг/кг, в/в), после чего регулярная стимуляция с частотой 2, 4 и 8 имп/с вызывала зависимое от частоты увеличение тонуса желудка, несколько большее, чем до L-NAME. Стимуляция пачками импульсов с внутрипачечной частотой 10 и 20 имп/с (что соответствовало по общему числу доставляемых импульсов регулярной частоте 2 и 4 имп/с) уже не вызывала релаксации, а вызывала вдвое и втрое меньшее увеличение тонуса, а при пачечной стимуляции с частотой 40 имп/с (соответствует 8 гц непрерывной стимуляции) наблюдалось лишь очень слабое увеличение тонуса желудка. После атропинизации в этих же опытах в ответ на оба типа стимуляции возникала слабо выраженная релаксация.

Из этих данных вытекает, что низкочастотная регулярная стимуляция блуждающих нервов значительно эффективнее активирует холинергическое звено регуляции чем высокочастотная пачечная стимуляция, и обладает способностью активировать нитрергическое звено, что может быть выявлено, как правило, только после атропинизации. Преобладание первого и объясняет обычно наблюдаемое увеличение тонуса желудка в ответ на стимуляцию блуждающих нервов в регулярном режиме у животных без аторопинизации. Наоборот, высокочастотная пачечная стимуляция слабо активирует холинергические механизмы, но высоко эффективна в отношении нитрергического звена регуляции, преобладание которого и определяет характер эффективного ответа - релаксация желудка - у живиотных без предварительной атропинизации. Главный вывод и заключается в том , что в естественных условиях механизм рецептивной и адаптивной релаксации может заключаться в высокочастотном пачечном потоке эфферентной импульсной активности в блуждающих нервах, обеспечивающем облегчение релизинга NO и торможение релизинга ацетилхолина. Переключение потока эфферентной импульсации на низкочастотный регулярный режим приведет к увеличению тонуса желудка (за счет холинергических механизмов), либо поддержанию необходимо нормального его тонического состояния. Эти данные позволяют сделать и теоретический вывод о том, что не только общее число нервных импульсов, но и пачечный паттерн их следования в вегетативных нервах имеет важное информационное значение как один из способов эффективного управления висцеральными функциями.
 
Продолжение