Протеиназы и протеолиз

В.М.Степанов

(ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов; биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова)

Степанов Валентин Михайлович (1931–1997) – член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией химии белка Государственного НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, профессор кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Область научных интересов: химия и биохимия белка, энзимология, в особенности биохимия протеолитических ферментов, применение ферментов в органическом синтезе, энтомоцидные белки. Автор 360 научных публикаций и учебника “Строение и функции белков” (М., 1996).

Число протеиназ – ферментов, способных катализировать гидролиз пептидной связи, – весьма велико. Это в известной мере обусловлено разнообразием задач, “решаемых” этими ферментами, и множественностью субстратов, последовательно образующихся при расщеплении компактной белковой глобулы до коротких пептидов, а затем – до аминокислот [2, 4, 5]. Так, например, для того чтобы обеспечить полный ферментативный гидролиз коротких пептидов – завершающую стадию протеолиза – понадобится около трех десятков пептидаз (карбокси- и аминопептидазы различной специфичности, ди- и трипептидазы, настроенные на гидролиз пептидов определенного типа, и т.п.).
Для исчерпывающего гидролиза белков и пептидов, казалось бы, нет надобности в специфичных ферментах, однако сама природа биологического катализа диктует необходимость точного, а значит, специфичного связывания субстрата для эффективного катализа. Отсюда понятна необходимость существования множества пептидаз. Заметим, что экспериментально задача полного гидролиза всех пептидных связей в белке, чрезвычайно важная для аналитической биохимии, до сих пор не получила адекватного решения именно из-за необходимости использовать для этой цели очень большое число индивидуальных ферментов.
Однако не только многообразие пептидных структур в субстратах обусловило множественность протеиназ. Заметим, что протеолитические ферменты, в задачу которых входит первичная атака компактной белковой структуры, должны обладать весьма необычным комплексом свойств. Эффективное связывание белкового субстрата как важнейшая предпосылка успешного гидролиза требует образования фермент-субстратного комплекса, в котором участвуют по обе стороны атакуемой связи 5-7 аминокислотных остатков и соответственно 5-7 пептидных связей. Однако в компактной структуре глобулярных белков, составляющих большую часть белкового компонента питания, практически невозможно найти столь протяженные участки пептидной цепи, которые были бы доступны для взаимодействия с атакующим ферментом.
Таким образом, если отвлечься от случаев, когда пищеварение направлено на предварительно денатурированные белки, первичная протеолитическая атака должна обеспечить развертывание компактной структуры белка-субстрата, дестабилизовать его и тем самым открыть пути для действия других протеиназ и, в конечном счете, пептидаз. Очевидно, что необходимым условием продуктивной протеолитической атаки является обратимое на первых порах раскрытие отдельных структурных элементов, частичная денатурация белка-субстрата. Такое раскрытие возможно как результат внутренне присущей белковым структурам динамики, однако его вероятность резко возрастает в условиях, способствующих хотя бы временной неполной денатурации белка. Следовательно, протеиназы «первой линии» атаки должны иметь достаточно устойчивую пространственную структуру, способную сохраняться в условиях, благоприятных для денатурации белков-субстратов.
Действительно, уже первая протеиназа, с которой субстрат встречается в пищеварительном тракте млекопитающих, пепсин, адаптирован к действию в отчетливо кислой среде, сохраняя стабильность при весьма низких значениях рН, в условиях, когда отрицательные заряды карбоксилатных групп в боковых цепях почти полностью нейтрализованы, а поверхность белка оказывается под воздействием положительно заряженных групп, стремящихся развернуть глобулу и вызвать денатурацию белка. Характерно, что пепсины млекопитающих, как правило, бедны аминокислотными остатками, боковые группы которых несут положительные заряды. Например, в свином пепсине их, считая и N-концевую аминогруппу, всего четыре. Разумеется, минимизация числа катионных групп – только один, и не обязательно главный, механизм, определяющий необычную стабильность этого фермента в кислых средах.
Следует отметить, что обычно регистрируемый на белковых субстратах весьма низкий оптимум рН для гидролиза пепсином, видимо, отражает не столько собственно величину, необходимую для эффективного действия функциональных групп каталитического центра, но и кислотность, требуемую для денатурации обычных глобулярных белков, тогда как пепсин сохраняет стабильность. Как показано в нашей лаборатории Г.И.Лавреновой и сотрудниками, оптимум рН пепсина по пептидным или денатурированным белковым субстратам находится вблизи рН 3, как и у химозина. По-видимому, этими же факторами объясняется повышенная стабильность пепсина, субтилизина и некоторых других протеиназ в присутствии весьма жестких денатурирующих агентов – концентрированных растворов мочевины, хлоргидрата гуанидина, а также додецилсульфата натрия, показанная в нашей лаборатории И.А.Залуниным, В.В.Анисимовой и др. [1, 3].
Однако следует учитывать, что исчерпывающий гидролиз белковых субстратов, при всей его важности, никак не является единственной функцией системы протеолитических ферментов. По всей вероятности, реакции ограниченного протеолиза, регулирующие активность и саму судьбу многих белков, играют чрезвычайно ответственную физиологическую роль. Указанные выше требования особой стабильности для ферментов, обеспечивающих ограниченный протеолиз, вряд ли значимы.
Отмеченная общность свойств вовсе не означает одинаковости или однотипности протеиназ, призванных атаковать белковые субстраты. Очевидно, что развитие протеолитических систем относится к весьма ранним этапам эволюции, причем эти ферменты возникали многими независимыми путями, а их каталитические центры имели во многих случаях совершенно различную структуру. Впрочем, параллельное, независимое друг от друга, возникновение больших групп - таксонов протеиназ, наделенных однотипно построенными каталитическим центрами, - довольно обычное событие. Оно имеет ту же природу, что и конвергентное, независимое развитие однотипных органов и других биологических структур у эволюционно не связанных организмов, испытывающих сходное давление отбора. Эволюционный подход был применен к систематике и исследованию протеиназ и протеолиза раньше, чем ко многим другим ферментам, поэтому именно на их примере формировались и формируются основные концепции эволюционой энзимологии.
Классом (по другой номенклатуре – типом) называют совокупность ферментов, каталитические центры которых обладают более или менее сходной структурой. При этом пространственная структура ферментов одного и того же класса может быть сходной, но нередко оказывается совершенно отличной. Ферменты одного класса, имеющие аналогичное строение и, очевидно, являющиеся потомками одного и того же фермента-прототипа, относят к одному семейству (или клану). Таким образом, как следствие конвергентной эволюции к одному классу могут принадлежать несколько семейств. Для отнесения той или иной протеиназы к одному из классов обычно достаточно выявить ее специфические ингибиторы, избирательно блокирующие характерный ансамбль функциональных групп в активном центре.
Отнесение к семейству сложнее и, строго говоря, требует знания пространственной структуры, что сопряжено со значительными сложностями и обычно происходит на весьма поздних стадиях исследования. Часто для этой же цели применяют сопоставление первичных структур, иногда их фрагментов. Если доля совпадающих аминокислотных остатков превышает 25-30%, это указывает на однотипность способа свертывания полипептидной цепи. Сложнее, если процент совпадений меньше, что не позволяет судить о сходстве пространственного строения, хотя в действительности оно и может иметь место.
Понятия класса и семейства оказались весьма продуктивными. Однако определение класса со временем утратило первоначальную жесткость и в настоящее время относится не к строго определенной, а скорее к более или менее однотипной структуре каталитического центра. Для понятия «семейство» критически важно сходство пространственной укладки полипептидной цепи, а не численная оценка близости первичных структур. Последний критерий, полезный прагматически, отказывает при сопоставлении отдаленных ферментов, что неоправданно умножает число эволюционно независимых семейств.
Особенно продуктивным путем эволюции семейств протеиназ явилось присоединение к каталитическому ядру одного и того же типа структурно и функционально автономных доменов весьма различной природы. Этот механизм критически важен для регуляции протеиназ и протеолиза.
Так, например, в эволюции протеиназ системы гемостаза, родственных трипсину, но построенных гораздо сложнее, большая роль принадлежала присоединению к собственно каталитическому ядру – домену, структурно и функционально родственному трипсину, ряда дополнительных доменов, так называемых «кринглов», каждый из которых имеет свои функциональные задачи. Это позволяет обогатить функциональные возможности ферментов. Например, один из присоединенных доменов, в котором остатки глутаминовой кислоты посттрансляционно превращаются в гамма-карбоксиглутаминовую кислоту, служит для связывания проферментов с фосфолипидами мембраны, обеспечивая их локальное концентрирование. Другие домены способствуют удерживанию фермента в контакте с субстратом и т.д. Следует подчеркнуть, что доля простых монофункциональных ферментов невелика. Они часто в ходе эволюции приобретали дополнительные функции за счет присоединения новых блоков.
При всем многообразии протеиназ число их классов невелико. Хорошо описаны четыре, но, вероятно, их несколько больше, поскольку можно говорить еще о двух-трех. Однако трудно предположить, что оно превысит десять, к тому же некоторые классы, например, сериновых и цистеиновых протеиназ, химически весьма близки. По-видимому, принципиально различных ансамблей функциональных групп, которые были бы способны эффективно катализировать гидролиз пептидных связей, немного в силу одинаковости задачи и ограниченности набора функциональных групп, которым располагают белки.
По-видимому, в дополнение к указанным особый класс образуют протеиназы, активный центр которых образован серином и лизином, а также окси- и альфа-аминогруппой треонина. Однако следует подчеркнуть, что обнаружение протеолитических ферментов новых классов – событие весьма редкое.
Было бы упрощением считать границы между классами протеолитических ферментов незыблемыми. В действительности, например, строение каталитических центров, а следовательно, и основные черты механизма действия сериновых и цистеиновых протеиназ, довольно близки. Это дает основание полагать, что эти классы принадлежат одному суперклассу. Разумеется, простая замена, например, серина в каталитическом центре сериновой протеиназы на цистеин, вряд ли приведет к эффективно действующему ферменту. Однако известны случаи, в особенности среди протеиназ вирусов, когда такой переход, вероятно, имел место, очевидно, сопровождаясь рядом других аминокислотных замен.
Эволюция функциональных центров не обязательно ограничивается переходами протеиназа – протеиназа или даже гидролаза – гидролаза, на что указывает родство сериновых карбоксипептидаз, постпролиновых протеиназ, эстераз, липаз, галоидалкил-гидролаз и даже некоторых белков, лишенных каталитических функций. Отдельные черты каталитического механизма протеиназ встречаются у функционально удаленных ферментов, что говорит о большой распространенности конвергентных процессов. Аналогичные протеолизу механизмы трансформации пептидных связей играют важную роль при внутримолекулярном негидролитическом расщеплении пептидных цепей при процессинге ферментов, в частности в реакциях внутрибелкового сплайсинга.
Число семейств также, по-видимому, достаточно ограниченно. Впрочем, есть тенденция полагаться при отнесении протеолитических ферментов к тому или иному семейству только на сопоставление соответствующих последовательностей аминокислот. Однако хорошо известно, что пространственная структура белка гораздо более консервативна в ходе эволюции, чем первичная структура. Ввиду этого родственными, то есть имеющими аналогично свернутые в пространстве полипептидные цепи, могут оказаться ферменты, которые обнаруживают лишь отдельные идентичные аминокислотные остатки при сравнении - “выравнивании” их последовательностей.
Так, например, по данным нашей лаборатории, при сравнении последовательностей глутамилэндопептидаз бактерий неизменны — консервативны только пять аминокислотных остатков из 215. В то же время попарное сравнение этих ферментов, результаты исследования их функциональных свойств указывают на то, что эти ферменты родственны и образуют, видимо, единое подсемейство в семействе химотрипсинов.
Переоценка сопоставления первичных структур, безусловно, мощного метода, имеющего, однако, немало ограничений, искусственно умножает число семейств протеиназ.
Заслуживает особого рассмотрения вопрос об эволюции специфичности протеолитических ферментов. Как уже говорилось, она необходима не только для обеспечения направленности действия фермента, но и потому, что эффективный катализ невозможен без достаточно точного, а значит, специфичного связывания субстрата в активном центре.
Следует также иметь в виду, что наиболее характерная детерминанта специфичности вовсе не является единственной (а часто и не главной) особенностью структуры субстрата, определяющей его взаимодействие с протеиназой. Даже у трипсина, избирательность которого в отношении остатка, образующего расщепляемую этим ферментом пептидную связь, так называемая первичная специфичность, выражена достаточно четко – нельзя пренебрегать “вкладом” других, относительно удаленных остатков субстрата в процесс. Такая «вторичная» специфичность часто оказывается настолько значимой, что фермент представляется неспецифичным. Это, разумеется, неверно, и речь идет о многофакторной специфичности.
Не следует также забывать, что обычно принятое описание специфичности в терминах последовательности аминокислот, прилегающей к атакуемой пептидной связи, не учитывает роли пространственного фактора, нередко являющегося решающим. Так, калликреин, тромбин и некоторые другие протеиназы системы гемостаза при испытании на пептидных субстратах обнаруживают специфичность, более или менее близкую трипсину, хотя и отличаются от последнего вторичной специфичностью. Однако пространственная организация вблизи каталитического центра этих ферментов существенно иная. Например, в случае калликреина, построенный так же, как и в трипсине, каталитический центр окружен характерными пептидными петлями, как бы погружен в воронкообразную структуру. В результате он недоступен для белковых субстратов, если они не несут подходящей по специфичности аминокислотной последовательности на выступе, комплементарном впадине фермента.
Таким образом, набор детерминант, определяющих соответствие субстрата первичной специфичности протеиназы, не столь уж велик. Впрочем, в него входят едва ли не все остатки, которые несут какую-либо характерную группу – ионную или гидрофобную – в боковой цепи аминокислотного остатка. Выбор возможных решений оказывается и в этом случае, как и при выборе групп, образующих каталитический центр, относительно ограниченным. Этим определяется большая вероятность получения функционально сходных решений (конвергентной эволюции) при формировании критически важных участков в зонах связывания субстратов. Однако есть весьма существенная разница с эволюцией каталитических центров. Функционально сходная структура, например гидрофобная впадина, может быть образована с участием разнообразных аминокислотных остатков. Поэтому эквивалентность приводит в таких случаях к структурно весьма различным образованиям, разным наборам аминокислотных остатков, и конвергенция далеко не так очевидна.
Следует заметить, что ферменты разных семейств и классов оказались способными приобретать сходные типы специфичности. Например, нетрудно увидеть похожесть структурных детерминант специфичности у трипсина и карбоксипептидаз типа В, хотя избирательное связывание аминокислотных остатков с катионными боковыми группами – аргинина и лизина – достигается в этих случаях различными способами. То же относится к протеиназам, предпочтительно связывающим субстраты с гидрофобными аминокислотными остатками: такие встречаются среди сериновых, цистеиновых, металло- и аспартильных протеиназ. Можно думать, что развитие зон связывания происходило в эволюции протеолитических ферментов как бы независимо от формирования каталитических центров и носило, в известном смысле, вторичный, подчиненный характер.
Список литературы

Anisimova V.V., Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N. et al. // Int.J.Peptide Protein Res. – 1996. – Vol. 47. – P. 28 – 35.
Hartley B.S. // Philos. Trans. R. Soc. – L., 1970. – Ser. B 257. – P. 77 – 87.
Orth P., Zalunin I.A., Gasparov V.S. et al. // J.Prot.Chem. – 1995. – Vol. 14. – P. 241 – 250.
Rawlings N.D., Barrett A. // Biochem. J. – 1993. – Vol. 290. – P. 205 – 218.
Stepanov V.M. In Evolutionary Biochemistry and Related Areas of Physico-Chemical Biology / Ed. B. Poglazov et al.; Bach Institute of Biochemistry and ANKO. – Moscow, 1995. – P. 409 – 423.
Лекция на XIV школе-семинаре «Современные проблемы физиологии пищеварения, Пущино-на-Оке, 1997, опубликовано в Российском журнале гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии 1998, №1, стр. 37-41