В.М.Бондаренко, В.А.Белявская
НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва;
НИИ биоинженерии ГНЦ вирусологии и биотехнологии “Вектор”, Кольцово, Новосибирской обл.
Молочнокислые бактерии, в том числе представители родов Lactobacillus, Streptococcus и Lactococcus, благодаря своей безопасности для человека и их широкому использованию в пищевой и фармацевтической промышленности, давно привлекают внимание специалистов в генной инженерии. Однако использованию молочнокислых бактерий в качестве объектов для клонирования препятствует слабая по сравнению с другими классическими объектами (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) генетическая изученность и отсутствие подходящих векторов для клонирования. Сама процедура трансформации до недавнего времени была трудоемкой и мало эффективной.
Использование электропорации во многом способствовало развитию генной инженерии лактобацилл и лактококков и усовершенствованию методов клонирования. Кроме молочнокислых бактерий поименованных выше, к этой же группе принадлежат и представители родов Leuconostoc, Pediococcus, Micrococcus и др. Определенная степень геномного родства многих из указанных видов бактерий позволяет конструировать и использовать векторы на основе известных плазмид, арсенал которых достаточно широк.
Большой интерес для медицинской практики представляют данные по использованию генетически модифицированных микроорганизмов, перспективных для конструирования препаратов-пробиотиков, обладающих максимальным спектром заданных полезных свойств. К таким свойствам относится продукция бактериями антибиотикоподобных и различных целевых белков иммунокомпетентных клеток человека, гены которых клонированы на различных векторах и переданы в определенный штамм-носитель.
В настоящее время насчитываются десятки рекомбинантных штаммов микроорганизмов, несущих гены, ответственные за синтез α, β и γ-интерферонов, различного типа интерлейкинов (ФНО-α и β, ИЛ-1, ИЛ-6, α-1 тимозина, гранулоцит-макрофаг колоний стимулирующего фактора и др.).
Одно из наиболее современных и интенсивно разрабатываемых направлений при создании генно-инженерных препаратов-пробиотиков нацелено на использование живых бактериальных векторов доставки гетерологичных иммуногенных эпитопов, сочетающихся с доставкой цитокинов, индуцирующих местный протективный иммунитет.
Для лечебно-профилактических препаратов, создаваемых на основе бактериальных векторов доставки, преимуществом является простота изготовления, не требующая дорогостоящей очистки лекарственной субстанции и заключающейся в получении биомассы, с последующей ее сублимацией, что в свою очередь обеспечивает простоту их хранения. Пероральный прием также является наиболее простым и безопасным способом введения таких препаратов.
Многие исследователи подчеркивают, что эффективность доставки целевого белка в организм бактериальным вектором зависит от многих факторов: природы и способа введения бактерии–носителя, эффективности экспрессии гетерологичных эпитопов и цитокинов в иммунологически активной форме.
Однако широкое внедрение в медицинскую практику генно-инженерных штаммов ограничено возможным их пока непредсказуемым влиянием на организм теплокровных и экологию окружающей среды. Полагают, что это может быть связано с появлением у интродуцента новых свойств, способствующих усилению его конкурентной способности, и возможностью нарушения равновесия экосистем. Кроме этого дискутируется возможность неконтролируемого переноса клонированной ДНК “новым хозяевам. Многие исследователи отмечают сохраняющийся разрыв между теоретическими концепциями, описывающими возможные негативные последствия внедрения генетически модифицированных микроорганизмов в практику и экспериментальными данными, подтверждающими их экологическую безопасность.
Цель настоящего сообщения – анализ данных по биологической безопасности и эффективности генно-инженерных бактерий Bacillus subtilis 2335/рВМВ-105, синтезирующих α-2-интерферон человека.
Данные о биобезопасности бактерий B.subtilis 2335/105, продуцирующих α-2 интерферон человека.
Для экспериментального изучения “судьбы” генетически модифицированного штамма B.subtilis Inf+ в кишечном тракте теплокровных с целью оценки возможности спонтанной передачи рекомбинантной плазмиды рВМВ-105, несущей клонированные гены интерферона и маркер устойчивости к канамицину, от интродуцента бактериям нормальной микрофлоры в качестве реципиентов нами были выбраны лактобациллы, как представители доминирующего звена желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Вначале из коллекции лактобацилл были отобраны штаммы, чувствительные к канамицину.
Следует отметить, что устойчивость к канамицину широко распространена среди различных видов молочнокислых бактерий, в том числе колонизирующих ЖКТ. Получить трансформанты лактобацилл, содержащие гибридную плазмиду pBMB-105(Kmr), контролирующую синтез интерферона, удалось лишь путем электропорации. Эффективность трансформации при этом составила менее 102 клеток на 1 мкг плазмидной ДНК. Полученные результаты свидетельствуют о наличии риска “горизонтального переноса” ДНК. Однако электропорация является искусственным способом введения гетерологичной ДНК, не имеющим ничего общего с естественными процессами переноса ДНК.
В последующих экспериментах при изучении выживаемости интродуцента, определенной в динамике после оральной аппликации штамма-интродуцента с учетом времени его пребывания в кишечном тракте (от момента введения до полной элиминации) путем высева из фекалий мышей, телят и цыплят, было показано, что клетки B.subtilis Inf+ не приживаются в кишечнике теплокровных, а полностью элиминируются из организма в течение 2-3 дней у мышей, 4-5 дней у цыплят и 5-7 дней у телят (рис.1).
Рис.1. Выживание бактерий B.subtilis Inf+ в организме теплокровных
Влияние интродуцента на нормальный микробиоценоз кишечного тракта мышей, изученное по изменению численности доминирующих микробных популяций, присутствующих у клинически здоровых мышей, показало, что после 3-кратного (1-й, 3-й и 7-й день) введения клеток B.subtilis Inf+ численность и соотношения в доминирующих таксономических группах нормофлоры остались практически неизменными (бифидобактерии - 108 КОЕ/г фекалий, энтерококки - 106 КОЕ/г, эшерихии - 105 КОЕ/г, лактобактерии - 104-105 КОЕ/г.
При этом была отмечена высокая стабильность популяционного уровня лактобактерий. Было исследовано также влияние интродукции B.subtilis Inf+ на количественный и качественный состав нормофлоры телят. У 6 телят до интродукции B.subtilis Inf+ показатели были в пределах нормы и остались таковыми в течение всего срока наблюдения после перорального введения интродуцента. Эти данные свидетельствуют об отсутствии негативного влияния интродукции генетически модифицированных бактерий B.subtilis Inf+ на микроэкологию ЖКТ животных.
Важными были эксперименты по оценке возможности “горизонтального переноса” гетерологичной ДНК, проведенной на мышах после бактериологического подтверждения полной элиминации интродуцента из организма. Широкое распространение канамицинустойчивости (Kmr) среди молочнокислых бактерий, наиболее вероятных реципиентов автономной плазмидной ДНК, не позволило использовать Kmr для поиска спонтанных трансформантов.
Поэтому воспользовались приемом, который состоял в выделении тотальной ДНК из бактерий природных популяций (представителей родов Bacillus, Bifidobacterium, Lactobacillus и Clostridium) с последующим проведением ПЦР при использовании специфических к изучаемому гену праймеров. Полученные результаты показали отсутствие данного гена в составе тотальной ДНК возможных реципиентов.
Далее были созданы модели гетеротрофных микроэкологических систем (МЭС), характеризующиеся наличием эндогенной микрофлоры, различных микроводорослей, инфузорий и дафний, состав и количество которых остается стабильным с небольшими сезонными и суточными изменениями после определенного установочного периода. Конструирование таких МЭС позволяет создать условия, максимально приближенные к естественным средам обитания. Гетеротрофные МЭС характеризуются наличием питательных субстратов, циркулирующих в виде продуктов жизнедеятельности живых сообществ. В наших экспериментах были использованы два типа гетеротрофных МЭС, отличающихся длиной трофических звеньев. Изучение последствия интродукции B.subtilis Inf+ в модельных водных экосистемах (микрокосмах) показало, что применение генетически модифицированных бактерий практически безопасно для окружающей среды, как в плане распространения генов Kmr, так и негативного влияния на водные микробиоценозы (табл.1).
Таблица 1 Состав и численность трофических звеньев модельных микрокосмов
МЭС
Время после интродукции, сут.
Водоросли
кл/мл
Простейшие
кл/мл
Дафнии
Бактерии
B. subtilis, кл/мл
кл/мл
Kmr,
%
Вегета-тивные клетки
споры
Kmr,
%
I
-165*
-75*
0,17
1
10
50
110
190
220
1,1х106
1,3х106
2,2х106
2,5х106
1,9х107
2,7х106
2,0х106
1,0х106
1,0х106
6,5х105
2,0х106
2,2х106
2,9х106
2,0х105
3,0х106
1,0х103
1,0х105
2,0х104
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,0х103
1,6х103
5,0х103
3,3х103
6,0х104
8,0х103
2,0х103
7,0х102
3,0х103
34,1
43,7
52,3
55,2
51,4
32,5
37,7
28,9
32,7
-
-
2,3х106
2,0х106
100
-
-
8
10
7
5
100
100
100
99
95
97
1
II
-165*
-75*
0,17
1
10
50
110
190
220
1.0х106
1,0х104
3,5х104
1,3х104
7,0х105
1,0х104
1,0х105
7,0х104
3,0х106
4,5х105
7,5х105
3,0х104
2,3х104
1,0х105
1,0х103
2,5х103
3,0х105
1,0х104
150
17
30
37
10
50
50
15
30
1,0х103
7,0х102
1,0х103
2,0х103
3,0х104
1,0х103
2,0х103
2,0х103
1,0х103
37,3
15,1
10,6
11,3
20,5
14,4
17,2
16,7
27,7
-
-
1,7х106
1,3х105
100
-
-
10
23
10
14
100
100
95
97
98
93
2
Примечание: * Количество дней с начала эксперимента до интродукции рекомбинантного штамма В. subtilis Inf+.
Иммуномодулирующее действие бактерий B.subtilis Inf+.
Известно, что под влиянием нормальной микрофлоры усиливается активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда, цитотоксическая активность натуральных киллеров и макрофагов, увеличивается продукция ИФ-α, ФНО-α, ИЛ-1 и ИЛ-6. Известно, что для большинства возбудителей инфекционных болезней слизистые желудочно-кишечного, урогенитального и респираторного трактов являются входными воротами инфекции, в связи с чем, индукция местного иммунного ответа является важной составляющей защиты организма от развития инфекционного процесса.
Многочисленные исследования показали высокую эффективность препаратов-пробиотиков при использовании оральных способов их введения, который является физиологически целесообразным. В силу физиологической общности иммунной системы слизистых, стимуляция иммунокомпетентных клеток ЖКТ сопровождается активацией иммунных реакций всех слизистых организма хозяина, предшествующей системному иммунному ответу организма.
При внеклеточной локализации возбудителя, как правило, обычно развивается гуморальный иммунный ответ, в основе которого лежит пролиферация В-лимфоцитов и синтез специфических иммуноглобулинов под действием цитокинов, продуцируемых Т-хелперами 2 типа (Th1), внутриклеточные же паразиты вызывают развитие клеточного иммунного ответа на основе формирования популяций антиген (АГ)-специфических Т-хелперов 1 типа (Th1) и цитотоксических Т-лимфоцитов.
Поскольку для развития АГ-специфического иммунного ответа требуется достаточно длительный период, более ранняя защита от инфекции обеспечивается как факторами естественной резистентности, реагирующими на проникший возбудитель мгновенно, к которым относятся макрофаги (МФ), нейтрофилы (НФ), естественные киллеры (ЕК) и IgG, так и быстро развивающимся индуцибельным неспецифическим ответом за счет активированных клеток системы естественной цитотоксичности (ЕЦ), цитокинов, а также регионарных γδ-Т клеток, рассматриваемых в качестве ранней АГ-специфической реакции. Вирусы неспецифически активируют неиммунные клетки (эпителиоциты) и антиген-представляющие клетки (макрофаги или дендритные клетки) слизистой к секреции высоких уровней ИФ-α, который является наиболее ранним ключевым цитокином, обеспечивающим наряду с другими цитокинами (ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-12, ИЛ-18) включение индуцибельных противоинфекционных механизмов.
Взаимодействуя со специфическими рецепторами клеток, ИФ-α способен, во-первых, индуцировать синтез антивирусных белков, приводящих к блокированию в этих клетках размножение вирусов, во-вторых, - неспецифически активировать эффекторы естественной цитотоксичности к цитолизису вирусинфицированных клеток, индуцировать местную и системную продукцию эндогенного интерферона, и, наконец, усиливать процесс взаимодействия антиген-представляющих клеток (АПК) с Т-клетками.
Установлено, что ИФ-альфа, синтезируемый АПК в процессе презентации антигена Тh0– лимфоцитам, индуцирует экспрессию специфического рецептора ИЛ-12 Rb1/b2 на Тh0 - клетках, обеспечивая их ответ на ИЛ-12, который, в свою очередь, стимулирует экспрессию рецепторов к ИЛ-18 на Т – лимфоцитах. ИЛ-18, синтезируемый АПК при стимуляции ИФ-альфа, приводит к ИЛ-18 – зависимой продукции Т – клетками ИФ-альфа, необходимого для развития Тh1 иммунного ответа. ИФ-альфа также активирует макрофаги для цитолиза вирус-инфицированных клеток. Все вышесказанное позволяет рассматривать ИФ-альфа как ключевой цитокин, являющийся связующим звеном между неспецифическим и адаптивным ответом организма на возбудитель, обеспечивающий формирование клеточного иммунитета.
Интерферон, появляющийся в просвете кишечника при пероральном введении, реализует свою биологическую активность через контактное взаимодействие с рецепторами эпителиальных клеток слизистой и иммунных клеток пейеровых бляшек. Не исключается и прямое проникновение интерферона в кровоток путем физиологического всасывания. Отмечается, что не высокие, а именно низкие дозы орально вводимого интерферона оказывают терапевтическое и иммунотропное действие. Принимая во внимание инициирующую позицию ИФ-альфа в цитокиновом каскаде, можно полагать, что его пероральное введение воспроизводит праймирующее действие индуцируемого в организме возбудителем эндогенного интерферона, являющегося связующим звеном между неспецифической резистентностью и антиген-специфическим иммунным ответом.
Показано, что противовирусное действие орально вводимого интерферона связано с его системным иммуномодулирующим эффектом. Адъювантный эффект орального ИФ-альфа в отношении индукции ИЛ-12, ИЛ-18, ИФ-γ, необходимых для Тh1 иммунного ответа, и его способность повышать выживаемость ранних клеток памяти на АГ, является определяющим в формировании специфического противовирусного иммунитета.
Разработка оральных форм интерферона продиктована необходимостью защиты лекарственной субстанции от деградирующего влияния протеолитического содержимого секретов слизистых трактов, при этом используются таблеточные, инкапсулированные и липосомальные формы. Альтернативным способом доставки интерферона к слизистым поверхностям являются препараты на основе живых рекомбинантных бактерий, продуцирующих интерферон. Иммунологическая активность B.subtilis Inf+ была показана в исследованиях на добровольцах (табл.2).
Таблица.2 Пролиферативная активность лимфоцитов и продукция цитокинов мононуклеарами крови добровольцев при пероральном приеме B.subtilis Inf+ (X ±m)
Показатель (имп/мин)
До приема
3-й день
7-й день
14-й день
ПРОЛИФЕРАЦИЯ
Спонтанная
1246±304
н/о
1437±413
1977±471
Индуцированная ФГА
33186±7445
н/о
58280±6900*
74074±14173*
СИНТЕЗ ЦИТОКИНОВ:
ИЛ-1 β
0
775±25*
35±35*
25±20*
ФНО- α
150±120
1150±290*
579±319*
400±147
ИЛ- 4
13.3±1,65
21±3.3*
20.0±0*
36,0±1,65*
ИЛ- 2
1.26±0.13
1.74±0.25*
1.42±0.12
1.8±0.08
Примечание: *- различия достоверны с группой «до приема», синтез цитокинов (пкг/мл)
По-видимому, перорально вводимые клетки рекомбинантного штамма B.subtilis Inf+ продвигаясь под действием перистальтики по ЖКТ, стимулируют синтез интерферона вблизи клеток–мишеней, локализующихся в слизистой. У мышей, инфицированных вирусом гриппа А и вирусом герпеса, было показано терапевтическое преимущество рекомбинантных бактерий по сравнению с исходным штаммом. В экспериментах с использованием модельной инфекции генитального герпеса у морских свинок антивирусная активность препарата отмечена при его применении в виде местных аппликаций.
Антивирусный эффект B.subtilis Inf+ связан с продукцией активированными иммунокомпетентными клетками эндогенного интерферона. Активирующее влияние B.subtilis Inf+ на перитонеальные макрофаги было оценено по их способности ингибировать пролиферацию опухолевых тест-клеток in vitro. Установлено, что введение здоровым животным и мышам с трансплантированными злокачественными опухолями оказывает выраженное антиметастатическое действие [6].
Пероральное введение B.subtilis Inf+ приводит к системной активации клеток-эффекторов периферических органов иммунной системы, удаленных от ЖКТ, при этом противоопухолевое и антиметастатическое действие не проявляется у «бестимусных» мышей, что свидетельствует о важной роли Т-лимфоцитов в системной активации иммунокомпетентных клеток периферических органов иммунной системы. Наблюдается также значительное повышение пролиферативной активности Т-лимфоцитов в селезенке интактных животных и в крови здоровых добровольцев.
В заключении следует отметить, что генетически модифицированные бактерии B. subtilis Inf+при пероральном применении синтезируют интерферон, проявляющий иммуностимулирующее, антивирусное и противоопухолевое действие. На основании результатов, полученных в экспериментах на теплокровных и на модели водных микроэкологических систем (микрокосмах), можно отнести полученные генно-инженерные бактерии к экологически безопасным микроорганизмам. По своему позитивному эффекту генно-инженерные бактерии, продуцирующие интерферон человека, являются обнадеживающими в плане их использования в качестве лечебно-профилактических препаратов-пробиотиков.
Литература
1. Белявская В.А., Кашперова Т.А., Бондаренко В.М. и др. Экспериментальная оценка биобезопасности генно-инженерных бактерий на модели штамма Bacillus subtilis, продуцирующего интерферон. Журн. микробиол.2001,2:16-20.
2. Белявская В.А., Чердынцева Н.В., Бондаренко В.М. и др. Биологические эффекты интерферона, продуцируемого рекомбинантными бактериями препарата-пробиотика субалина. Журн. микробиол.2003,2:102-109.
3. Бондаренко В.М., Белявская В.А. Клонирование и экспрессия генов в молочнокислых бактериях. Журн. микробиол. 2000, 2:67-73.
4. Бондаренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуномодулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков. Журн. микробиол.1998,5:107-112.
5. Сорокулова И.Б., Белявская В.А., Масычева В.И. и др. Рекомбинантные пробиотики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии. Вестн. РАМН. 1997, 3:46-49.
6. Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Белявская В.А и др. Роль макрофагов в реализации антибластомного действия рекомбинантного пробиотика субалина. Вопр. онкологии. 2001,47(1):86-89.
7. Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Белявская В.А. и др. Влияние рекомбинантного пробиотика субалина на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Бюлл. экспер. биол. 1999, 127(прилож. 1): 67-70.
8. Medaglini D., Pozzi G., King T.P. et al. Mucosal and systemic immune responses to recombinant protein expressed on the surface of the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oral colonization. Proc. Natl. Sci. USA. 1995, 92:6868-6872.
9. Steidler L., Robinson K., Chamberlain L. et al. Mucosal delivery of murine IL-2 and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect. Immun. 1998, 66:3183-3189.
10. Tovey M.G., Maury C. Oral mucosal interferon therapy: мarked antiviral and antitumor activity. J. Interferon Cytokine Res.1999, 19:145-147.
Источник: https://gastroportal.ru/nauchnye-uchrezhdeniya-shkoly/akademicheskaya-shkola-seminar-im-a-m-ugoleva/konstruirovanie-genno-inzhenernyh-preparatov-probiotikov-i-ih-bezopasnost.html
© ГастроПортал