Г.И. Клебанов
Кафедра биофизики РГМУ
В настоящее время установлено, что возникновение и развитие широкого круга воспалительных заболеваний сопровождается активацией свободнорадикальных реакций (СРР) перекисного окисления липидов (ПОЛ), денатурации белков и нуклеиновых кислот. Эти реакции называются так, потому что они инициируются и развиваются с участием т.н. свободных радикалов. Свободные радикалы – это молекулы или частицы, обладающие не спаренными электронами.
Образующиеся в клетке радикалы могут инициировать вторичные свободнорадикальные реакции, вступая во взаимодействие с различными клеточными компонентами: белками, нуклеиновыми кислотами и липидами (рис.1). В результате этих СРР происходит деградация молекул-мишеней с образованием более или менее стабильных продуктов реакций, идентификация и определение количества которых может быть параметром или маркёром, определяющим скорость СРР. Наиболее часто используемым маркёром инициации СРР является определение продуктов перекисной деградации фосфолипидов клеточных мембран и липопротеидов плазмы крови: коньюгированных диенов и гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот, алканов и альдегидов, в частности малонового диальдегида.
Рис. 1 Взаимодействие радикалов-инициаторов, активных форм кислорода
(О2 , Н2О2, ОН•) с различными компонентами клеток: нуклеиновым кислотами, мембранными фосфолипидами, арахидоновой кислотой (АК),
белками. (Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Окисление ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов называется перекисным, потому что первичным стабильным продуктом этого процесса являются гидроперекиси (ROOH). В результате происходит перекисная деградация молекул фосфолипидов, что влечёт за собой нарушение структуры клеточных мембран и липопротеидов. Рассмотрим основные принципы регуляции ПОЛ при различных воспалительных заболеваниях.
1.Активные формы кислорода – инициаторы свободнорадикальных реакций in vivo.
В нормальном состоянии функционирования организма скорость СРР пероксидации липидов клеточных и мембран и липопротеидов относительно мала, что обусловлено низким уровнем образования радикалов –инициаторов и действием сбалансированной системы антиоксидантной защиты. Однако в процессе возникновения и развития воспалительных заболеваний это равновесие нарушается, резко возрастает продукция радикалов-инициаторов и наблюдается инактивация системы антиоксидантной защиты, развивается т.н. оксидативный стресс.
Какова природа радикалов, способных инициировать процесс пероксидации липидов мембран и липопротеидов? Все радикалы, образующиеся в нашем организме как в норме, так и при возникновении и развитии т.н. «свободнорадикальных патологий» можно подразделить на две группы: природные и чужеродные.
Природные радикалы в свою очередь подразделяются по способу их образования и участию в дальнейших реакциях на первичные, вторичные и третичные [Владимиров, 2000]. Первичные радикалы образуются в реакциях с участием специализированных молекулярных механизмов (см. далее). Для непосредственного образования вторичных радикалов специализированных молекулярных машин в клетке нет, они формируются из первичных радикалов в результате последующих реакций. Ко вторичным радикалам следует отнести гидроксильный радикал, образующий из перекиси водорода при участии ионов металлов переменной валентности, и в какой-то мере пероксинитрит(ONOO), который является продуктом реакции между оксидом азота (NO) и супероксид анион радикалом кислорода.
Вторичные радикалы обладают значительно большей активностью и из-за этого наносят организму большой вред. И наконец, к третичным радикалам следует отнести радикалы, которые образуются при взаимодействии первичных и вторичных с молекулами антиоксидантов и каких-либо других легко окисляющихся веществ.
Чужеродные радикалы образуются в организме при действии экзогенных физико-химических факторов: ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, техногенные токсические продукты и т.д.
Первичные и вторичные радикалы являются в основном продуктами модификации молекулярного кислорода. Молекулярный кислород обычно не вступает в прямые неферментативные химические реакции с органическими соединениями тканей организма. Реакции с участием кислорода в живой клетке чаще всего происходят с участием ферментов – оксидаз. В ходе этих реакций могут образовываться промежуточные свободнорадикальные продукты восстановления кислорода, которые получили название – активные формы кислорода (АФК):
А. О2 - - супероксид анион радикал кислорода,
Б. 1О2 – синглетный кислород,
В. Н2 О2 – перекись водорода,
Г. ОН• - гидроксильный радикал.
2. Механизмы образования АФК при патологии
Ранее уже указывалось, что многие воспалительные патологии протекают в условиях активации СРР и в том числе ПОЛ. С другой стороны, возникновение и развитие различных воспалительных заболеваний характеризуются двумя хорошо контролируемыми стадиями: нарушением микроциркуляции (ишемия) и восстановлением кровотока (реперфузия). Поэтому для описания механизмов активации СРР при различных воспалениях рассматривают механизмы продукции АФК в цикле или циклах ишемия-реперфузия (И/Р) [Weiss,1984].
Среди систем или механизмов, обеспечивающих увеличение продукции АФК, способных запускать СРР перекисной модификации липидов клеточных мембран и липопротеидов следует выделить следующие:
Нарушение транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий.
Интенсификация синтеза и окисления катехоламинов.
Активация системы ксантин-ксантиноксидаза .
Активация фагоцитов.
Появление пула каталитически активных ионов металлов переменной валентности.
Таким образом, следует заключить, что в процессе возникновения и развития различных воспалительных заболеваний или при действии ряда физических факторов, например, излучений, резко увеличивается активность механизмов, продуцирующих АФК и увеличивается концентрация каталитически – активных ионов Fe2+ в циркуляции крови или локально в очаге воспаления.
Всё это вместе взятое приводит к валовой наработке реальных радикалов-инициаторов, способных запускать последующие СРР с участием различных субстратов и в том числе перекисного окисления липидов клеточных мембран и липопротеидов плазмы крови.
3. Влияние антиоксидантов на перекисное окисление липидов
Несмотря на то, что свободнорадикальное окисление липидов непрерывно протекает во всех тканях и органах человека и животных, оно не приводит к развитию их радикального повреждения, поскольку для каждого организма характерно поддержание указанного процесса на определенном стационарном уровне. Эта стационарность достигается за счет функционирования согласованной системы биоантиокислителей и хелаторов ионов металлов переменной валентности.
Существует много классификаций биоантиокислителей. По локализации их подразделяют на внутриклеточные и внеклеточные (табл.1).
По физико-химическим свойствам антиоксиданты подразделяются на жирорастворимые и водорасвторимые. В таблице 2 суммированы сведения о точках приложения действия различных антиоксидантов
Из таблицы 2 видно, что клетки и межклеточные жидкости располагают системой ферментных и неферментных механизмов контроля за содержанием АФК (О2. - , Н2О2, ОН., 1О2), свободных радикалов (RO2., R.), липидных гидроперекисей (ROOH), катализаторов ПОЛ (Fe2+). Многие АО имеют не один, а несколько механизмов действия и могут ингибировать процесс ПОЛ на разных стадиях его протекания.
Таким образом, в норме низкий уровень продукции радикалов-инициаторов и сбалансированная система антиоксидантной защиты приводит к тому, что скорость СРР ПОЛ клеточных мембран и липопротеидов плазмы крови крайне мала. Однако, в процессе возникновения и развития воспалительных заболеваний этот баланс нарушается, увеличивается эффективность стадии инициации СРР, а с другой стороны, уменьшается активность системы антиоксидантной защиты, что и приводит к ускорению свободнорадикального поражения компонентов клетки и липопротеидов.
Вклад всех компонентов эндогенной системы защиты липидов клеточных мембран и липопротеинов от перекисной деградации может быть определен путем измерения активности отдельных составляющих. Однако это оказалось практически невозможным из-за, во-первых, трудоемкости анализов и во-вторых, синергизма действия различных ингибиторов в системе защиты. Поэтому вот уже на протяжении 25-30 последних лет предпринимаются попытки создания методик для определения суммарной активности ингибиторов СРР, присутствующих в биологических жидкостях:сыворотке крови, моче, слюне, слезе, а также в гомогенатах тканей и суспензиях мембран и липопротеинов .
В принципе любая методика определения антиокислительной активности (АОА) какого-либо индивидуального ингибитора СРР, смеси их или биологических жидкостей основывается на использовании некой модельной системы, которая включает в себя по крайней мере 2 компонента: механизм генерации определенного сорта СР и систему их детектирования. Введение в такую модельную систему перехватчика СР или веществ, влияющих на концентрацию или состояние ионов-катализаторов, приведет к уменьшению концентрации СР или катализаторов, что отразится на параметрах детектирующей системы.
Для определения общей АОА биологических жидкостей применяются несколько модельных систем (табл.3), различающихся как по способу генерации СР, так методу их детектирования, по характеру фазы системы (гомогенная или гетерогенная), сложности интерпретации.
Одной из первых доступных и воспроизводимых модельных систем окисления, примененной для определения АОА сыворотки крови был предложенный Стоксом и др. в 1974 г. гомогенат мозга [Stocks,1974].
С помощью этой модельной системы было показано, что:
сыворотка крови и другие биологические жидкости ингибируют ПОЛ модельной системы, определяемое по увеличению концентрации вторичных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивные продукты).
В сыворотке крови основной вклад в общую АОА вносят сывороточные белки: церулоплазмин и трансферрин.
альфа-токоферол в физиологических концентрациях перекрывал лишь незначительную часть общей АОА сыворотки.
Альбумин, будучи добавленным к гомогенату в физиологических концентрациях, эффективно ингибировал накопление ТБК-реактивных продуктов, что могло быть обусловлено про мнению авторов, его способностью связывать различные лиганды и в том числе Fe2+ .
Т.о. гомогенат мозга в качестве модельной системы оказался пригодным для определения вклада железо-окисляющих и железо-связывающих компонентов в общую АОА биологических жидкостей, систем надзора за концентрацией и состоянием Fe2+ (церулоплазмина, трансферрина, альбумина и др.).
Другие компоненты общей АО системы сыворотки крови: аскорбат, урат, альфа-токоферол, каротиноиды и др. на свойства этой модельной системы окисления сколько-нибудь значительного влияния не оказывали.
В качестве другой модельной системы окисления для определения общей АОА сыворотки крови использовали суспензию липопротеинов желтка яиц (ЖЛП), инициирование ПОЛ в которой осуществляли с помощью ионов двухвалентного железа. Суспензия ЖЛП, как модельная система отличается от других липид-содержащих систем доступностью получения, высокой стабильностью и относительно хорошей окисляемостью [Клебанов,1988]. Уровень процесса ПОЛ определяли по:
накоплению ТБК-реактивных продуктов и выражали в количестве мкмолей малонового диальдегида (МДА) на 1 мл реакционной смеси,
интенсивности Fe2+ -индуцированной хемилюминесценции.
При введении сыворотки крови в суспензию ЖЛП, было обнаружено (рис.4, кривая2) уменьшение интенсивности ХЛ на стадии медленной вспышки. Поскольку такое влияние сыворотки крови на интенсивность ХЛ суспензии ЖЛП сопровождалось, как было показано нами ранее, параллельным снижением накопления ТБК-реактивных продуктов в реакционной среде, то оно может быть вызвано действием находящихся в сыворотке различных ингибиторов ПОЛ.
Есть основания предположить, что наблюдаемое торможение ПОЛ модельной системы сывороткой крови обеспечивается главным образом сывороточными белками или связанными с ними веществами. Действительно, инактивация сывороточных ингибиторов ПОЛ путем нагревания сыворотки при 900 С 15 мин приводило к отмене ее ингибирующего влияния на ПОЛ суспензии ЖЛП. Более того, введение в модельную систему предварительно нагретой сыворотки крови привело к соокислению липидов ЖЛП и липопротеинов сыворотки, что проявилось в увеличении интенсивности ХЛ (рис. 2, кривая 3). Аналогичная ситуация наблюдалась и при введении в модельную систему липосом, которые проявляли себя в роли дополнительного субстрата окисления (рис. 2, кривая 4) Необходимо отметить, что тепловая обработка сыворотки крови практически не сказывалась на окисленности сывороточных липидов, определяемую по количеству ТБК-реактивных продуктов и содержанию альфа-токоферола (данные не приведены), в то время как активность одного из основных плазменных ингибиторов ПОЛ, церулоплазмина , снизилась с 4,40+-0.52 отн. ед-ц./мл до 1,30+-0,26 отн. ед-ц/мл (Р< 0,001) т.е. более чем в 3 раза по сравнению с контролем.
Рис. 2. Влияние на Fe2+ -индуцированную хемилюминесценцию желточных липопротеидов (1) в фосфатном буфере (40 мМ) нативной (2) и инактивированной нагреванием при 900С в течение 15 мин (3) сыворотки крови, а также липосом (4)
По оси ординат – интенсивность хемилюминесценции в отн ед-х.
Общий объём реакционной смеси – 10 мл. Объём добавленной сыворотки – 0,5 мл, липосом – 1 мл (20 мг/мл фосфолипидов) Стрелкой обозначен момент введения раствора FeSO4 ( 2,5 мМ) (Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Введение сыворотки крови в суспензию ЖЛП приводило к уменьшению интенсивности ХЛ суспензии ЖЛП по мере увеличения объема добавляемой сыворотки. Это обстоятельство позволило для определения общей АОА сыворотки крови, как величины, не зависящей от ее объема, введенного в модельную систему, использовать прием, разработанный для случая модели жидкофазного окисления [Петрусевич,1972] и основанный на том, что скорость изменения концентрации пероксильных радикалов без и в присутствии ингибиторов в условиях стационарности реакций окисления описывается следующими уравнениями:
d[RO2•] 0 / dt = Wi - k6 [RO2•]2 0= 0
d[RO2• ] /dt = W - k6 [RO2•]2 - k7[InH][RO2•] = 0 где:
Wi - скорость инициирования свободных радикалов.
[RO2•] 0, [RO2•] - концентрация пероксильных радикалов без и в присутствии антирадикального ингибитора соответственно,
k6 - константа скорости реакции рекомбинации пероксильных радикалов.
K7 - константа скорости реакции обрыва цепей окисления в результате взаимодействия антиоксиданта и пероксильного радикала.
[InH] - концентрация антиоксиданта.
Решение этих уравнений дает связь между интенсивностью ХЛ системы без ингибиторов (I0) и после их введения (I)
бетта-коэфициент антиокислительной активности ингибитора.
В нашем случае бетта - параметр, характеризующий суммарную АОА сыворотки крови, а поскольку состав и молярные концентрации сывороточных антиоксидантов в модельной системе не известны, то вместо [InH] в формулу подставляется объем (V) добавленной сыворотки. Практически коэфициент бетта вычисляли как тангенс угла наклона линейного участка кривой, построенной в координатах :
Используя описанный выше прием, была исследована АОА сыворотки крови больных с неосложненным инфарктом миокарда, которым проводилась традиционная медикаментозная терапия. Было обнаружено (рис.3,А), что в острый период инфаркта миокарда у всех обследованных пациентов наблюдалось увеличение уровня общей АОА сыворотки крови с последующим снижением до нормального значения к 7-14 дню заболевания. Что же касается активности церулоплазмина в сыворотке крови этих больных (рис.3,Б) , то в отличие от АОА, она повышалась постепенно, достигая своего максимального значения только к 5-7 дню течения инфаркта миокарда, когда уровень АОА сыворотки крови уменьшался уже почти в 2 раза по сравнению с его первоначальным максимальным значением. Важно подчеркнуть, что аналогичным образом в динамике инфаркта миокарда изменяется содержание и другого ингибитора ПОЛ - мочевой кислоты. Все это свидетельствует в пользу того, что увеличение общей АОА сыворотки крови в острый период инфаркта миокарда, на 1-2 сутки заболевания происходит, по-видимому, не за счет церулоплазмина, а с участием каких-то других сывороточных ингибиторов ПОЛ.
Рис. 3. Динамика общей антиокислительной активности (а), определяемой с помощью суспензии ЖЛП и активности церулоплазмина (б) сыворотки крови больных инфарктом миокарда.
По оси абсцисс – длительность наблюдений , в сутках. По оси ординат: а – величина коэфициента
Заштрихованные участки на графике – границы норм. (Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Вместе с тем следует признать, что модельная система окисления на основе ЖЛП, несмотря на свою простоту и доступность не позволяет в полной мере использовать возможности хемилюминесцентного метода в интерпретации механизма действия различных антиоксидантов и АОА биологических жидкостей.
Вот почему для более точного изучения механизма действия различных АО и АОА сыворотки крови была использована Fe2+ -индуцированная хемилюминесценция суспензии липосом, сформированных из общей фракции фосфолипидов желтка яиц в Трис-HCl буфере. Эта замена позволяет применить для интерпретации эффектов действия различных индивидуальных АО и АОА биологических объектов теорию хемилюминесцентных реакций, разработанную Ю.А. Владимировым.
Было обнаружено, что по мере увеличения концентрации комплексонов двухвалентных ионов величина тау хемилюминограмм уменьшается. Увеличение концентрации аскорбата приводило наоборот, к увеличению длительности латентного периода.
С другой стороны, введение в мембраны липосом каротиноидов: бетта-каротина и ликопина сопровождалось концентрационно-зависимым тушением интенсивности медленного свечения практически при постоянстве значений тау.
И наконец, при исследовании действия альфа-токоферола и рутина было обнаружено, что использованные перехватчики СР уменьшают как длительность латентного периода, так и амплитуду ХЛ.
При введении в суспензию липосом 5 мкл сыворотки крови (рис.4,А ) было обнаружено сокращение длительности латентного периода и уменьшение интенсивности медленного свечения. Результаты титрования суспензии липосом плазмой крови представлены на рис.4,Б. Видно, что увеличение объёма вводимой сыворотки до 50 мкл сопровождалось уменьшением амплитуды ХЛ на 40-50%, в то время как длительность латентного периода уменьшилась практически до 0. Причем, важно подчеркнуть, что основное тушение ХЛ модельной системы произошло при введении минимальных объёмов сыворотки крови. Так, 5 мкл сыворотки крови дали 30% тушения ХЛ суспензии липосом. Дальнейшее увеличение объёма вводимой сыворотки оказывало значительно меньшее влияние на интенсивность медленного свечения.
Рис. 4 Влияние плазмы крови на форму кинетики (А) и изменение параметров ХЛ (Б)
Концентрация вводимого раствора FeSO4 - 20 мкМ. Цифры у кривых на рис.- объём добавленной плазмы в мкл I - амплитуда медленного свечения в отн. ед-х. Т - длительность латентного периода хемлюминограммы в мин. (Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Таким образом, основным эффектом действия антиоксидантной системы сыворотки крови на Fe 2+ -индуцированную хемилюминесценцию суспензии липосом является уменьшение длительности латентного периода хемилюминограммы. В этом отношении сыворотка крови идентична действию EDTA, десферала , а также церулоплазмину и альбумину.
Следующая модельная система для определения АОА биологических жидкостей, нашедшая широкое применение в лабораторной и клинической практике была предложена в 1987 г. Вайнером с сотр. [Wainer,1987]. Это водная гомогенная система на основе 21,2 азо-бис(2 амидинопропан)гидрохлорид (АБАП). Принцип действия этой системы (рис. 17) состоит в том, что в водной среде при 370 АБАП претерпевает термоиндуцированную деградацию с образованием пероксильных радикалов (RO2•), которые могут взаимодействовать с различными перехватчиками (табл.2.)
При использовании АБАП было обнаружено, что введение в модельную систему небольшого количества сыворотки крови приводит к появлению определенного латентного периода, на протяжении которого происходит перехват пероксильных радикалов АБАП плазменными ингибиторами и отсутствию их эффекта действия на молекулы-мишени.
Для тестирования количества таких перехватчиков в плазме крови был использован водорастворимый аналог альфа-токоферола - тролокс, введение которого в концентрации 10-5 М приводило к схожим эффектам, что позволило представлять АОА сыворотки крови и других биологических жидкостей в виде эквивалентной концентрации тролокса. Разделение сыворотки крови на фракции позволило выстроить основные сывороточные ингибиторы в следующий ряд по их активности: аскорбат>SH-группы белков>урат>витамин Е. Важно подчеркнуть, что плазменный альфа-токоферол в этой системе не вносил существенного вклада в общую АОА сыворотки крови.
В качестве ещё одной водной, гомогенной модельной системы, пригодной для тестировния антиокислительной активности индивидуальных ингибиторов СРР и АОА биологических жидкостей была предложена система, содержащая гемоглобин-перкись водорода-люминол [Клебанов,1999]. В данной системе использовали коммерческий препарат гемоглобина, в составе которого содержиться значительная часть метгемоглобина (MetHb). Принцип действия модельной системы Hb-Н2О2-люминол состоит в том,что взаимодействие MetHb с Н2О2 приводит к образованию феррил радикалов Hb (•X-FeIV =O). Указанные радикалы индуцируют свободнорадикальное окисление люминола, сопровождающееся ХЛ. Параллельно этому часть феррил производных Hb, по-видимому вновь взаимодействуют с избытком Н2О2, которое заканчивается их деградацией с выходом свободного Fe3+.Эти ионы железа восстанавливаются О2 до двухвалентного состояния Fe2+ и при взаимодействии с пероксидом водорода в реакции Фентона образуют гидроксильные радикалы, ОН•, способные окислять люминол, вызывая люминол-зависимую ХЛ.
Было обнаружено, что добавление Н2О2 в реакционную среду, содержащую Hb и люминол, сопровождалось развитием ХЛ (рис.5, кривая 1). При этом свечение развивалось примерно через 1 мин после введения Н2О2 (латентный период), достигая максимальных значений на 5-7 минутах и далее постепенно уменьшалось.
Рис.5. Кинетики ХЛ системы Hb -Н2О2-люминол без и в присутствии различных объёмов сыворотки крови ( цифры на кривых). Реакционная смесь содержала: 0,21 мкМ Hb, 10 мкМ люминола, 20 мкМ Н2О2, в 50 мМ KH2PO4, 100 мкМ EDTA,рН=7,4. Стрелкой показан момент времени ввода Н2О2. (Для увеличения картинки щелкните на ней мышкой)
Введение в модельную систему сыворотки крови человека приводило к изменению параметров кинетики ее ХЛ: понижению интенсивности свечения и увеличению латентного периода (t). Такое влияние сыворотки крови на параметры ХЛ модельной системы может быть обусловлено наличием в ней различных антиоксидантов, способных перехватывать АФК и радикалы люминола.
При исследовании действия основных сывороточных ингибиторов было обнаружено, что значение С50% колебалось в пределах от 0,001 мкМ (каталаза) до 11,89 мкМ (трансферрин) и не зависел от природы ингибитора, тогда как увеличение отношения t/to в большей степени было характерно для низкомолекулярных антиоксидантов - альфа-токоферола, урата, аскорбата и восстановленного глутатиона, чем для белковых - церулоплазмина, альбумина и трансферрина. Причем зависимость длительности латентного периода хемилюминограммы модельной системы от концентрации аскорбата оказалась линейной. Это дало возможность выражать АОА различных веществ и биологических жидкостей, проявляющуюся в изменении этого параметра в аскорбатном эксвиваленте, т.е. в молях аскорбата , увеличивающего латентный период в той же степени. В табл. 4 приведены величины АОА сыворотки крови, мочи, слез, синовиальной жидкости, выраженные в аскорбатном эквиваленте. Видно, что наибольшей АОА обладает моча, а наименьшей - церебро-спинальная жидкость. Однако эти результаты свидетельсвуют лишь о возможности метода определения АОА биологических жидкостей. Что же касается виличины этой актитвности, то она засисит от большого количества факторов и может изменяться в засисмости от стадии заболевния.
Выводы.
В организме существует сбалансированная система антиоксидантного надзора за состоянием СРР, состоящая из водо- и жирорасторимого пула перехватчиков первичных и вторичных радикалов, хелаторов (окислителей) ионов металлов переменной валентности.
Сбой в активности системы эндогенных АО на фоне усиления продукции радикалов-инициаторов приводит к возникновению и развитию т.н. «свободнорадикальных патологий»
Разработанные модельные системы окисления определения АОА позволяют определять:
Активность и механизм действия различных ингибиторов СРР и их смесей, например, разлиных биологических добавок к пище АО действия.
Осущстлять предклинический дизайн новых синергических препаратов (БАД)
Отслеживать эффективность действия индивидуальных АО и их смесей (БАД)
на уровень АО защиты в биологических жидкостях организма.
Литература
Weiss J.J./ Oxygen, ischemia and inflammation // Acta Physiol. Scand. 1984.- Suppl. 548. P.9-37.
Stocks J., Gutteridje J.H., Sharp R., Dormandy T./ Assay using brain homogenate for measuring the antioxidant activity of biological fluids// Clin. Sci. Mol. Med. 1974. – V.47, (3) .P. 215-222.
Г.И. Клебанов, И.В. Бабенкова, Ю.О. Теселкин,/ Оценка антиокислительных свойств плазмы крови с применением желточных липопротеидов// Лабораторное дело.- 1988 - №3 – С. 59-62.
Ю.А. Петрусевич, Я.С. Славинский/ Сверхслабые свечения в биологии. М. Наука 1972 С.60-67
Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков/ Перекисное окисление липидов биологических мембран. 1972.- М. Наука.
Wainer D.D.M. / Radical-trapping antioxidants in vitro and in vivo// Bioeletrochem. Bioenerg. 1987. V.18 (1-3) P.219-229.
Клебанов Г.И. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Владимиров Ю.А./ Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестн Росс. Акад мед. наук. 1999 ,№2. С15-22.
Лекция на XVI школе-семинаре «Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения, Пущино-на-Оке, 14-17 мая 2001 года, опубликовано в Приложении №14 к Российскому журналу гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии «Материалы XVI сессии Академической школы-семинара имени А.М. Уголева «Современные проблемы физиологии и патологии пищеварения», 2001, том XI, №4, стр. 109-118
Таблица 1 Основные компоненты антиокислительной системы организма человека
Локализация
Компонент
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ
1. Антиоксиданты
а) гидрофобные
(встроенные в мембраны)
Токоферолы (витамин Е), убихиноны,
b-каротин, ликопин
б) цитозольные
(свободно плавающие в цитоплазме или в комплексе с цитоплазматическими белками)
Аскорбиновая кислота, тиоловые аминокислоты(цистеин), тиоловые трипептиды (глутатион), фенольные аминокислоты (тирозин), катехоловые аминокислоты (ДОФА), кортикостероиды
2. Энзиматические перехватчики
Супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатион-редуктаза
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ
1. Антиоксиданты
а) гидрофобные
- Входящие в состав липопротеинов
- Связанные с сывороточными белками
б) гидрофильные
Токоферолы (витамин Е), b-каротин, ликопин, кортикостероиды, билирубин
Аскорбиновая кислота, мочевая кислота, церулоплазмин, альбумин
Таблица 2 Компоненты антиокислительной системыи обезвреживаемые ими факторы активации ПОЛ
Биоантиокислитель
Механизм действия
Жирорастворимые
Витамин Е
Витамин А и
каротиноиды
Стероидные гормоны
Билирубин
О2.-, НО2., ОН., 1О2
RO2. (R.)
RO2. (R.), 1О2
RO2. (R.)
RO2. (R.), 1О2
Водорастворимые
Супероксиддисмутаза
Каталаза
Глутатионпероксидаза
Церулоплазмин
Трансферрин
Лактоферрин
Альбумин
Витамин С
Глутатион
Мочевая кислота
О2.-
Н2О2
Н2О2, ROOH
Fe2+_____> Fe3+,О2.-,OCl-
Fe3+ (связывание), OCl-
Fe3+
О2.-, OСl-
RO2. (R.), О2.-, In.> InH
RO2.
ОН., 1О2, Fe2+, Fe3+, RO2.
Таблица 3 Методы исследования АОА плазмы крови
Система генерации СР
Способ детектирования АОА
Фотоокисление люминола
Фотохемилюминесценция
Hb-H2O2-люминол
Люминол-зависимая хемилюминесценция
Автоокисление гомогенатов мозга
ТБК-реактивные продукты
Fe2+-липосомы
Хемилюминесценция
Fe2+-эмульсия линолевой кислоты
ТБК-реактивные продукты
Fe2+-cуспензия ЖЛП
ТБК-реактивные продукты
Водорастворимые азосоединения:
АБАП
АБАП-фикоэритрин
АБАП-люминол
АБАП-эмульсия линолевой кислоты
Циклическая вольтаметрия
Флуоресценция
Хемилюминесценция
Полярография
Гидрофобные азосоединения
Хемилюминесценция
Термоокисление линетола
Гидроперекиси
Электроокисление тирозина
Электрохемилюминесценция
Дифенил-пикрилгидразил
Спектрофотометрия
Таблица 4 АОА некоторых биологических жидкостей организма человека в модельной системе гемоглобин-пероксид водорода-люминол.
Биологическая жидкость
АОА, мМ
Моча
Здоровые доноры (n=5)
3.362±0.566
Плазма крови
Здоровые доноры (n=7)
0.664±0.038
Синовиальная жидкость
Больные ревматоидным артритом (n=3)
Больные реактивным артритом (n=7)
0.260±0.025
0.253±0.013
Влага передней камеры глаза
Больные катарактой (n=3)
0.227±0.020
Церебро-спинальная жидкость
Здоровые доноры (n=6)
0.045±0.005
Источник: https://gastroportal.ru/nauchnye-uchrezhdeniya-shkoly/akademicheskaya-shkola-seminar-im-a-m-ugoleva/antioksidantny-antioksidantnaya-aktivnost-metody-issledovaniya.html
© ГастроПортал