В клинической практике гастроэнтерологов нередко возникает необходимость воздействовать на процессы регенерации в гастродуоденальной зоне. В последние годы в связи с успехами молекулярной биологии существенно изменились представления о механизмах регуляции репаративных процессов. Воздействие на эти процессы требует осторожного подхода и глубокого понимания основных закономерностей.
Следует осознать, что вычленение отдельных компонентов этих процессов и воздействий регуляторных факторов носит условный характер, так как в организме они тесно связаны и переплетены между собой. После ознакомления с современными взглядами на общие закономерности регенераторных процессов мы конкретизируем их в отношении слизистой оболочки желудка, в частности в условиях геликобактерной инфекции.
Регенерацией (возрождением) называют процесс восстановления разрушенных или утраченных тканей, органов и отдельных частей тела живых существ.
Различают физиологическую и репаративную регенерацию.
В многоклеточном организме физиологической регенерацией называют процесс постоянного обновления клеток различных тканей. Биологический смысл процесса регенерации у многоклеточного организма заключается в восстановлении структуры, способной к выполнению специализированной функции. Достигается это либо восстановлением клеточной массы органа за счет гиперплазии клеток (клеточный тип регенерации), либо путем гиперплазии клеточных ультраструктур (внутриклеточный тип регенерации).
В ходе репаративной регенерации при восстановлении клеток, поврежденных патологическим процессом, включаются дополнительные механизмы, способствующие ускорению клеточного обновления. Репаративная регенерация может быть полной (реституция) при замещении дефекта тканью идентичной предсуществовавшей ткани и неполной (субституция), когда дефект ткани замещается тканью с более низким уровнем организации, например рубцом. В последние годы установлено, что при репаративной регенерации в органах формируются принципиально новые клеточные линии с новыми функциональными свойствами.
Если в ходе репаративной регенерации имеется извращение регенераторного процесса в виде избыточного или недостаточного образования регенерирующей ткани, например образование келоида, или превращение одного вида ткани в другой (метаплазия), то говорят о патологической регенерации. Причиной ее служит нарушение общих или местных механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки клеток (при хроническом воспалении, неполноценном питании, нарушениях иннервации, физико-химических воздействиях). Этот вид регенерации относится к пограничным состояниям и нередко является одним из звеньев канцерогенеза.
Основными компонентами регенераторного процесса являются: клеточная пролиферация и дифференцировка, миграция клеток, а также реструктуризация стромы и ангиогенез.
Под клеточной пролиферацией понимают увеличение количества клеток в ткани, тогда как дифференцировка - это прогрессивное возрастание разнородности в биохимизме клеток, обусловливающем выполнение специфической функции.
Миграция - это осуществляемое в процессе дифференцировки перемещение клеток эпителиального пласта вдоль базальной мембраны без отрыва от нее. При этом каждая новая локализация клетки придает ей новый дифференцировочный статус.
Реструктуризация стромы заключается в изменении клеточного состава и компонентов межклеточного матрикса собственной пластинки слизистой оболочки.
Процессы пролиферации и дифференцировки клеток в нормальных тканях организма теснейшим образом связываются понятием "клеточный путь".
Клеточный путь - это путь, который проходит клетка от родоначальной до специализированной, способной к выполнению определенной функции. Этапы клеточного пути (шаги) - это смена клеточных циклов.
Процессы пролиферации и дифференцировки клеток в ходе клеточного цикла идут параллельно и относительно автономно. Судьба клетки зависит от того, какой из этих процессов протекает быстрее.
Если подготовка к митозу произойдет быстрее, то клетка переходит в G1 фазу, и ее деление будет неизбежным. В противном случае клетка успеет продвинуться по пути дифференцировки настолько, что перейдет в фазу G0 следующего цикла (G0'). Длительность последней больше, чем фаза G0 предыдущего цикла, но теперь и времени для формирования механизмов митоза требуется больше. Время генерации клетки приближается ко времени ее жизни. Вероятность вступления в митоз уменьшается.
Дифференцировка у многоклеточных организмов - процесс постепенный. Должно смениться несколько поколений клеток, прежде чем будет достигнуто окончательное и стабильное дифференцированное состояние.
Английский эмбриолог Уодингтон предложил для описания представления о дифференцировке модель наклонной плоскости, по которой катится шарик. Недетерминированная клетка проходит при этом определенные дифференцировочные уровни, порог которых при нормальных условиях преодолим лишь в одном направлении.
На определенных этапах пути шарик попадает в дифференцировочные ямы, отражающие состояние относительной стабильности. Выйти из этого состояния клетка может в трех направлениях:
- приступив к выполнению специализированной функции;
- продолжив пролиферативный процесс, что возвращает ее на дифференцировочную плоскость;
- инициировав механизм апоптоза.
Схематически низший уровень на такой плоскости соответствует максимальной дифференцировке, то есть клетке с легко верифицируемым фенотипом, а схематически высший уровень соответствует идеальной зародышевой клетке, из которой может быть получен любой клеточный тип, входящий в организм данного вида.
В генетическом отношении дифференцировка клеток не является следствием коренных изменений генома, а определяется физико-химическими факторами, влияющими на геном. Разобщенные клетки не способны к дифференцировке. Дифференцировка одной клетки или клеток, изолированных друг от друга, невозможна.
Эксперименты с пересадкой ядер показали, что дифференцировка не связана с утратой или добавлением генетической информации. Ядро клетки любой ткани организма содержит одну и ту же генетическую информацию, но в большинстве дифференцированных клеток эта информация надежно заблокирована.
По теории открытого генома генетическая информация в недифференцированной клетке полностью открыта. Открытыми называются участки ДНК, доступные для молекул РНК-полимеразы, и, следовательно, для транскрипции с последующим синтезом белка.
Допускается, что в идеальной зародышевой клетке могут синтезироваться (хотя и в минимальных количествах) все белки, возможные для данного организма.
По мере дифференцировки происходит открытие одних генов и закрытие других. На разных стадиях развития и у клеток различных типов различны и зоны открытой ДНК. Закрытие генов осуществляется путем связывания нитей ДНК с основными белками гистонового типа. При этом блокированные участки ДНК приобретают компактную конфигурацию и становятся недоступными для транскрипции.
Такие нуклеопротеидные комплексы формируют на нитях ДНК некое подобие бус и обнаруживаются на светооптическом уровне в виде зерен хроматина. В ядрах эмбриональных клеток в каждой такой бусинке заблокировано около 3-4 тыс. пар оснований, кодирующих генетическую информацию. В эухроматических участках активно функционирующих клеток взрослого организма имеется уже около 30 тыс. пар оснований, а в гетерохроматине нефункционирующих клеток - более 300 тыс. При этом разнообразие синтезируемых клеткой белков уменьшается. Однако количество каждого из оставшихся белков в клетке увеличивается, поскольку синтетическая мощность клетки остается постоянной. Белки становятся доступными для выявления биохимическими и иммунологическими методами.
Исходя из положений этой теории легко понять молекулярную суть процесса детерминации, которая заключается в предварительном синтезе информационной РНК и накоплении ее в цитоплазме частично детерминированной клетки. Специфических белков в клетке еще нет, фенотип клетки еще не проявился, но иРНК для его синтеза уже готова. При получении очередных регуляторных стимулов синтез белка начинается, и клетка приобретет соответствующий фенотип.
По мере дальнейшей дифференцировки весь синтетический потенциал клетки переключается на продукцию специфических белков, что приводит к формированию фенотипа клетки, дифференцированной в определенном направлении. Подтверждением такому ходу событий является обнаружение в различных органах клеток-микстов, то есть клеток, сочетающих в себе фенотипические признаки нескольких видов клеток.
В желудке методами гибридизации in situ были выявлены клетки, экспрессирующие мРНК одновременно к гастрину и соматостатину, то есть эта частично детерминированная клетка "определилась" с направлением дифференцировки в сторону эндокринных клеток, но "не решила" стать гастриновой G-клеткой или соматостатиновой D-клеткой.
Таким образом, именно процесс поэтапного блокирования одних генов и разблокирования других является основой механизмов дифференцировки. Осуществляется этот процесс путем индукции, то есть влияния внешних факторов и клеток друг на друга.
Регенерация тканей взрослого организма представляет собой каскад индукций. В результате сбоя этих регулировочных механизмов возможно формирование клеточных линий, утрачивающих способность к дифференцировке или с преобладанием пролиферативного компонента. Это одно из основных патогенетических звеньев канцерогенеза.
Начало изучению гуморальных механизмов клеточного обновления в желудке было положено открытием трофического действия гастрина и "антитрофического" действия соматостатина.
Гастрин непосредственно стимулирует митотическую активность клеток-предшественников фундальных желез, усиливая в них синтез ДНК. Гиперпродукция гастрина, как правило, ведет к гиперплазии слизистой оболочки фундального отдела желудка. Гастрин синтезируется в антральном отделе желудка специализированными клетками - G-клетками.
Действие соматостатина на слизистую оболочку желудка можно назвать "антитрофическим" лишь условно, так как непосредственного влияния на пролиферативные процессы этот гормон не оказывает. Однако он обладает свойством подавлять секрецию гастрина, а также разнообразных биологически активных веществ, усиливающих пролиферативные процессы.
Блокирование пролиферативных и моторных стимулов соматостатином приводит к удлинению фазы покоя (G0) клеточного цикла и тем самым создает благоприятные условия для процессов клеточной дифференцировки. Секретируется соматостатин D-клетками антрального отдела желудка. В меньшем количестве и более равномерно D-клетки распределены и по другим отделам желудочно-кишечного тракта.
Факторы роста представляют собой самую многочисленную группу индукторов пролиферации и дифференцировки клеток. Эпидермальный фактор роста (EGF), который продуцируется клетками слюнных желез и выделяется со слюной, а также трансформирующий фактор роста a (TGF-a) и инсулиноподобный фактор роста (IGF) усиливают клеточную пролиферацию и угнетают процессы дифференцировки.
Трансформирующий фактор роста b (TGF-b) обладает прямо противоположным действием. Он ингибирует клеточную пролиферацию и способствует дифференцировке клеток.
Фактор роста кератиноцитов (KGF) стимулирует как пролиферацию, так и дифференцировку клеток.
TGF-a цитохимически выявляется на мембранах тубуловезикул париетальных клеток и в цитомембранах главных клеток. Он способствует подавлению кислой желудочной секреции и является сильным митогеном, то есть способствует заживлению язвенного дефекта.
Следовательно, присутствие в слизистой оболочке желудка зрелых, активно функционирующих париетальных клеток - необходимое условие для нормального обновления эпителия желудка, так как они являются источником факторов роста. Блокирование активности париетальных клеток приводит к нарушению процессов клеточного обновления в слизистой оболочке желудка.
EGF и TGF-a обладают вазодилатирующими свойствами, способствуя ангиогенезу в области язвенного дефекта и усиливая репаративные процессы. Однако увеличение экспрессии рецепторов к EGF, что наблюдается во всех случаях рака желудка независимо от гистологического типа, повышает восприимчивость опухолевых клеток к стимулам, усиливающим пролиферацию.
Фактор роста гепатоцитов (HGF) вырабатывается активированными фибробластами в собственной пластинке слизистой оболочки желудка. Он обладает митогенным действием и способствует миграции клеток, влияя на элементы цитоскелета. В эксперименте он существенно ускоряет заживление острых язв. Причем заживление язвенного дефекта осуществляется в две фазы: ранняя фаза заключается в миграции эпителиальных клеток по направлению к дефекту слизистой оболочки желудка, поздняя фаза - в инициации пролиферативной активности клеток. HGF ускоряет обе эти фазы.
К недавно открытым регуляторам клеточного цикла относится и семейство трефоиловых пептидов, получившие название по своеобразной трехлопастной структуре своих молекул.
Пространственная структура трефоиловых пептидов представляет собой три петли, состоящие из полипептидных цепей, соединенных дисульфидными мостиками. Они продуцируются слизеобразующими клетками слизистой оболочки желудка и кишки в норме, но их продукция многократно возрастает при образовании дефекта эпителиального пласта.
TFF1(pS2) и TFF2(SP - spasmolitic polypeptide), участвующие в процессах клеточной дифференцировки, локализуются преимущественно в слизистой оболочке антрального отдела желудка и дуоденальных (бруннеровых) железах.
По данным электронно-микроскопической иммуноцитохимии, Ps2 и hSp локализуются на цитомембранах, включая мембраны комплекса Гольджи слизеобразующих клеток. Они включаются в состав слизистых гранул, вместе с которыми и высвобождаются в просвет.
TFF3 (ITF - intestinal trefoil factor) локализуется преимущественно в энтероцитах. Главная его роль заключается в стимуляции процессов миграции дифференцирующихся клеток от зон генерации до зон функциональной активности. Кроме того, TFF3 вызывает фрагментацию ДНК и морфологические изменения, характерные для апоптоза.
Все трефоиловые пептиды существенно замедляют рост опухолевых клеток. Эти вещества чрезвычайно устойчивы к действию пищеварительных ферментов и оказывают регуляторные воздействия, находясь в просвете желудочно-кишечного тракта. Интересно, что они присутствуют и в цитомембранах эндокринных клеток желудочно-кишечного тракта, включаются в состав их эндокринных гранул, вместе с которыми секретируются в собственную пластинку слизистой оболочки. Значение этого регуляторного механизма пока не изучено.
Комбинированное воздействие факторов роста и трефоиловых пептидов позволяет оптимизировать процессы регенерации за счет уменьшения пролиферативного компонента.
К белкам, контролирующим процессы пролиферации и дифференцировки, можно отнести также и белки - регуляторы апоптоза. Это ген-супрессор p53. Он подавляет пролиферацию клеток и индуцирует апоптоз в случае обнаружения повреждений ДНК в фазе G2 клеточного цикла, то есть обладает явными антионкогенными свойствами. Кодируемый им белок р53 обнаруживается в ядре в течение S и G2 фаз клеточного цикла. Однако мутации в этом гене способны его полностью преобразить, и он приобретает свойства усиливать рост опухолей.
Для реализации своих функций р53 нуждается в генах семейства bcl, белковые продукты которых оказывают порой диаметрально противоположное действие на апоптоз и пролиферацию. Так, белок bcl-2 подавляет апоптоз через блокаду кальциевых каналов клеточных мембран, усиливает пролиферацию и способствует дифференцировке клеток.
Местом локализации bcl-2 в клетке являются внутренние мембраны митохондрий и ядро клетки. Другие гены этого семейства (Bax, bclXS), наоборот, синнергически взаимодействуют с р53, подавляя пролиферацию и усиливая апоптоз.
Таким образом, баланс между белковыми продуктами этих генов определяет равновесие между пролиферацией и апоптозом.
Стромально-паренхиматозные взаимоотношения обеспечиваются взаимодействием адгезивных молекул межклеточного матрикса и ингриновых рецепторов клеток. Распределение молекул адгезии по оси желудочных желез существенно влияет на клеточную кинетику. Так, менее вязкие и более текучие ламинин и тенасцин преобладают в зонах с повышенной миграцией клеток, тогда как более вязкие Е-кадгерин и фибронектин - в зоне концевых отделов желез с низким темпом миграции клеток. Этим обусловлено и их влияние на процессы пролиферации и дифференцировки.
Такие составные компоненты межклеточного вещества, как Е-кадгерин и коллаген IV, подавляют миграцию клеток вне генеративных зон, создавая условия для их дифференцировки, не воздействуя на процессы пролиферации. Е-кадгерин используется для построения плотных межклеточных контактов. Роль его в норме мало изучена. Он препятствует обратной диффузии кислот (но не щелочей) из просвета желудка.
Мутациям генов, кодирующих синтез молекул адгезии, придается большое значение в механизмах инфильтративного роста и метастазирования опухолей. За последние 3 года резко возросло количество публикаций, посвященных этому вопросу. Основной их смысл сводится к тому, что рост опухоли (как пролиферация) и инвазия регулируются различными механизмами. При этом главным в механизмах инвазивного роста является снижение экспрессии или мутация генов адгезивных молекул, в частности Е-кадгерина.
Мутации в генах, кодирующих синтез Е-кадгерина, приводят к развитию диффузного рака желудка с ранним метастазированием и плохим прогнозом. Заболевание это имеет семейный характер. Такие мутации не встречаются при раке желудка кишечного типа. Тест на выявление растворимых фрагментов Е-кадгерина в крови рекомендуется для использования в качестве маркера диффузного рака желудка.
Особенность слизистой оболочки желудка состоит в наличии 3 функционально различных отделов - кардиального, кислотопродуцирующего и пилорического. Хотя клеточный состав этих отделов различен, однако пролиферативная организация обновления едина. Желудочный тип архитектоники обновления характеризуется наличием генеративной зоны в области перешейка железы и биполярной миграцией клеток.
Индекс включения тимидиновой метки (следовательно, и синтеза ДНК) клетками перешейка очень высок - за 30 мин метку включают 32% клеток этой области. Большая часть (85%) вновь образованных клеток мигрирует в сторону просвета желудка, формируя во всех отделах ямочный и поверхностный эпителий с временем обновления около 10 дней. Другая часть клеток, определяющих функциональную специализацию органа, мигрирует в сторону дна желез и имеет несколько направлений дифференцировки (клеточных линий) с различным временем обновления - от 30 до 200 дней.
Признаки функциональной специализации проявляются в них по мере продвижения к базальным отделам железы. Раньше всего (уже в области шеечных отделов желез) фенотипические признаки проявляются в париетальных клетках. По мере продвижения в глубь железы в париетальных клетках нарастают инволютивные изменения, в цитоплазме накапливаются фаголизосомы и резидуальные тельца. В дальнейшем происходит их элиминация из эпителиального пласта в просвет железы либо деструкция с последующим фагоцитозом клетками собственной пластинки. Время обновления эндокринных клеток - около 60 дней.
Линии эндокринных, главных и париетальных клеток в области шеечных отделов желез проходят стадию клеток-предшественников. Процессы дифференцировки различных клеточных линий могут регулироваться автономно под влиянием различных гуморальных факторов клеточного микроокружения.
Согласно данным, полученным в последнее время на трансгенных мышах, париетальные клетки играют решающую роль в механизмах дифференцировки шеечных клеток в главные клетки. Репаративная регенерация при острых повреждениях слизистой оболочки желудка осуществляется по типу реституции с полным восстановлением структуры и функции.
Однако при хронических патологических процессах часто возникают сбои в работе регуляторных механизмов клеточной пролиферации и дифференцировки, что приводит к субституции (атрофия главных желез при атрофическом гастрите, образование рубца на месте хронической язвы) либо к патологической регенерации (кишечная метаплазия). После гастрэктомии или частичной резекции у взрослого организма полного восстановления желудка как анатомо-физиологического образования не происходит.
UACL-клетки - регуляторы репаративной регенерации. Картины "псевдопилорической метаплазии" в кислотопродуцирующем отделе желудка и "пилорической метаплазии" в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки встречаются довольно часто. Всегда считалось, что это определенная разновидность недифференцированных клеток, которые, продуцируя слизь, предохраняют слизистую оболочку от действия кислотно-пептического фактора, а в дальнейшем дифференцируются в нормальные железистые структуры.
Однако исследованиями Н. Райта с использованием современных морфологичесаких, иммуногистохимических методик и методов гибридизации in situ установлено, что эта группа клеток представляет собой отдельную дифференцировочную ветвь, происходящую из стволовых клеток. Эти клетки характеризуются определенным фенотипом: они продуцируют нейтральные мукополисахариды, выявляемые ШИК-реакцией (в отличие от окружающих слизистых клеток, продуцирующих кислые муцины).
Кроме того, они секретируют большое количество регуляторных пептидов и других индукторов пролиферации или дифференцировки окружающих клеток: EGF, TGF-a, FGF, некоторые из трефоиловых пептидов и лизоцим, обладающий бактерицидным действием.
Наконец, эти клетки имеют свою собственную архитектонику воспроизведения, подобную пилорическим железам желудка. Так как эти клетки появляются в слизистой оболочке только при хроническом воспалении и эрозивно-язвенных повреждениях, они были названы клетками UACL - ulcer-associated cell lineage.
Большой объем информации накоплен по влиянию Helicobacter pylori на процессы пролиферации и дифференцировки клеток в слизистой оболочке желудка. Развитие этой инфекции приводит к усилению пролиферативных процессов в слизистой оболочке желудка. Однако установлено, что эффект этот обусловлен не прямым действием H. pylori, а опосредован повышением уровня гастрина в крови.
Следствием прямого непосредственного действия H. pylori на эпителиальные клетки желудка является усиление апоптоза. Действие это проявляется как при геликобактерном гастрите, когда задействованы все механизмы воспалительных реакций, так и in vitro на культуре эпителиальных клеток желудка, когда участие факторов воспалительной реакции исключается. При этом не только усиливается апоптоз, но и наблюдается фрагментация ДНК.
Повреждение молекул ДНК - один из ведущих факторов канцерогенеза. В условиях геликобактерного гастрита такие повреждения могут вызываться активными формами кислорода. Генерация супероксиданиона, гидроксильного радикала, перекисных соединений нейтрофилами и макрофагами создает микроокружение, способствующее канцерогенезу. Более того, H. pylori также содержит ферментные системы, способные к генерации активных форм кислорода, что может быть причиной усиления апоптоза клеток слизистой оболочки желудка, в том числе и в условиях тканевой культуры.
Известно также, что в условиях геликобактерной инфекции уровень образования активных форм кислорода в слизистой оболочке желудка всегда выше, чем в отсутствие H. pylori, даже при одинаковой степени инфильтрированности ее нейтрофилами и макрофагами. Исходя из этих данных следует подчеркнуть, что весьма важным фактором профилактики рака желудка являются антиоксидантные ферменты и витамины (Е), существенно снижающие риск развития этого заболевания.
