Изучение цитоагглютинирующих активностей (фитолектиновой, рассасывающей агглютинаты и агглютинирующей цветными примесями) в растительных композициях

д.б.н. В.М.Лахтин, Корсун В.Ф., М.В.Лахтин, Корсун Е.В.
ГУ «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ»; РУДН
В последние годы значительно расширился научный и практический интерес к поиску и использованию природных средств, обладающих противомикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью. В значительной степени этому соответствуют растительные лектины, которые являются сложными белками, металлосодержащими гликопротеидами (В.Ф. Корсун и соавт.,1998, 2000, 2004). В основе биологической активности лектинов лежит феномен обратимого взаимодействия их с углеводами, которые определяют процесс узнавания макромолекул и клеток, взаимодействия по схеме: рецептор – молекула, влияя на транспортную функцию мембран клетки. К сожалению, многие факторы происхождения лектинов, их содержание в растительных препаратах до сих пор мало изучены.
Нами предпринята попытка изучить цитоагглютинирующую активность (фитолектиновую, рассасывающую агглютинаты и агглютинирующие цветные примеси) ряда фитопрепаратов, содержащих лектины.
Методы исследований
Получены и охарактеризованы две высокочувствительные клеточные тест-системы (эритроцитарная и дрожжевая) для скрининга фитоагглютининов. На примере дрожжей разработан метод анализа агглютинатов бесцветных нативных (без красителей) клеток с использованием компьютерного редактирования картин, полученных в режиме живого изображения в камере BioChemi (UVP, Ca., США). Метод позволяет выявлять взаимодействие Con A с дрожжами в концентрации лектина 0,4 мкг/мл. С помощью солевого фракционирования (с использованием нетоксичной соли – NaCl), центрифугирования, стерилизационной микрофильтрации (через Steriflip), мембранной ультрафильтрации (c cохранением фитолектинов с мол массой выше 30 кД и удалением низкомолекулярных неспецифических агглютининов и возможных эндогенных ингибиторов фитолектинов), мембранного концентрирования (с 5-8 мл до 0,2-0,5 мл) и промывания концентратов в нужном буфере (в центрифужных патронах для ультрафильтрации – Centricon plus20) получены препараты (по 0,2-0,5 мл) фракций I, II и III из экстрактов 6 фитокомпозиций. Для фракций I-III проведен анализ трех цитоагглютинирующих активностей (фитолектиновой, рассасывающей агглютинаты, агглютинирующей цветными примесями) и гемолитической активности, дана оценка стабильности картины агглютинации при хранении планшетов в холодильнике. Исследована модуляция (ингибирование, активирование, стабилизация) трех цитоагглютинирующих активностей фракций I и II в присутствии синтетических гомополисахаридных растворимых полимеров – аналогов дрожжевого альфа-(фосфо)маннана [Man-альфа-PAA, Man-P-PAA] и хитина/хитозана [GlcNAc-бета-PAA], а также бета-галактана [Gal-бета-PAA]. Установлены два перспективных источника фитолектинов: а) Фитокомпозиция N 2 ( фракция II) с содержанием значительного количества лектина, сходного с Con A по альфа-маннан-специфичности; б) Иван-Чай (фракция II) с содержанием фитолектина, специфичного к хитину/хитозану/ олигомерам N-ацетилглюкозамина. В целом, разработанные методы получения фракций I-III и визуального экспресс-анализа цитоагглютининов в планшете позволяют выявлять агглютинины (фитолектины и другие) с мол массой выше 30 кД в 250 мг сырья (на примере веса содержимого одной капсулы Чаговита). Максимальная фитолектиновая активность выявлялась в Чаговите.
Были исследованы:

ФитоГоР (сбор из 7 трав: кукурузные рыльца+шалфей+ многоколосник+котовник+календула+мелисса+мята,
пакетики по 1,9 гр, фитолектиновый комплекс, лектины
совместимы между собой, иммуномодулятор, ингибитор
вирусов).
ХитоКор (травы: кукурузные рыльца+шалфей+многоколосник+
котовник+календула+мелисса+мята+Иван-чай, с
хитозаном+МКЦ+аэросил, таблетки по 0,5 гр, БАД,
флавоноиды >4,5 мг/таблетка, противовирусный,
противомикробный, противовоспалительный).
ИВАН-ЧАЙ (сбор, молодые листья ферментированные,
гранулированные, с добавлением цветов кипрея, без
кофеина, пакетики по 0,75 гр, успокаивающее).
ЧАГА (березовый гриб, мелко измельченный, пакет – 50 гр;
Фирма Фиточай, Иркутск).
ЧАГОВИТ (экстракт чаги с аскорбиновой кислотой и витаминами
группы В, в капсулах по гр, Институт канцерогенеза,
Москва).
ФИТОКОМПОЗИЦИЯ N 2 (чага+корни шлемника
байкальского+плоды рябины сибирской, мелко
измельченные, пакет – 50 гр; Фитодар, Иркутск;
противоопухолевая, успокаивающая, гипотензивная,
спазмолитическая).
В тексте были использованы сокращения:

ВМБ(2+) веронал-мединаловый буфер (10 мМ) изотонический
(0,85% NaCl) с 0,5 мМ MgCl2 и 0,15 мМ СаСl2
ГА гемагглютинирующая активность, гемагглютинация
ЗФР ЗФР забуференный физиологический раствор рН 7,4 (10 мМ),
фосфатный (0,85% NaCl) рН 7,4
(10 мМ фосфатно-солевой буфер с 0,145 М NaCl)
ИЧ – Иван-чай
ПС полисахарид(ы)
РАА рассасывающая агглютинаты активность
Ф2 – фитокомпозиция N 2
ФГ – ФитоГоР
ХК - ХитоКор
Ч - чага
ЧВ – чаговит
Эц эритроциты
Сon A конканавалин А из бобов канавалии (Jack been, Canavalia
ensiformis L.), лектин маннозо-альфа-/глюкозо-альфа-
/олигоманнозид/маннан-альфа/глюкан-альфа-специфичный
Gal-бета-РАА синтетический аналог линейного растворимого бета-
галактана
GlcNAc-бета-РАА синтетический аналог линейного растворимого
хитин-подобного ПС (N-ацетил-бета-D-глюкозаминилового
ПС)
Man-альфа-РАА синтетический аналог линейного растворимого
альфа-маннана
ManP-PAA синтетический аналог линейного растворимого
фосфорилированного альфа-маннана
РАА полиакриламидный линейный растворимый в водных буферах
полимер (с боковыми ответвлениями в виде остатков
галактозы, маннозы, N-ацетилглюкозамина или
маннозофосфата; см. выше)
Результаты исследований
Получение фракций фитолектинов.
Экстракцию фитолектинов [ ИЧ – 2 пакетика-1,5 г, Ф2 – 1,0 г, ФГ – 1 пакетик-1,9 г, ХК – 2 таблетки-1,0 г, Ч – 0,8 г, ЧВ – 1 капсула-0,25 г) проводили посредством 10 мл ЗФР/гр растительного материала (в случае ЧВ – 20 мл/г), 1 ч при 40оС, перемешивание. Центрифугировали 4 тыс.х g, 20 мин и надосадок подвергали термообработке при 80оС 15 мин. К охлажденным до комн. температуры экстрактам добавляли сухой NaCl до получения насыщенной концентрации соли (присутствует нерастворяющийся осадок соли; добавить соль до увеличения объема экстракта в 1,3 раза) и оставляли на 2 ч при комн. т-ре. Центрифугировали (см. выше) и надосадок оставляли на ночь при 4оС для формирования осадка, а сильно окрашенный иногда маслянистый слой над солевым осадком смывали небольшим количеством чистого насыщенного раствора NaCl и отбрасывали, солевой осадок (фракцию I) исследовали. На следующий день после образования осадка экстракты из холодильника согревали до комн. температуры, центрифугировали (см. выше) и получали осадок (фракцию II) и надосадок (фракцию III).
Фракцию I (солевую) растворяли в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) рН 7,4 (7,5 мл), а фракцию II (холодовой ночной осадок) растворяли в дистиллированной воде (5 мл). Фракции I, II и III подвергали вакуумной микрофильтрации через Steriflip (Millipore, США), а фильтраты – центрифужной (см. выше) ультрафильтрации через мембрану в центриконе Centricon-plus20 (Millipore, США) для получения концентратов веществ с молекулярной массой выше 30 кД. Концентраты (100 мкл) промывали тем же объемом ЗФР (7,5 мл) повторным центрифугированием в центриконах и получали очищенные фракции I, II и III в ЗФР для тестирования фитолектинов.
Получение клеточных тест-систем.
Тестирование фитолектинов проводили в круглодонных полистироловых планшетах (ВНИИМедПолимер, Москва) с использованием свежеприготовленных трипсинизированных эритроцитов (Эц) человека А(II)(+)-группы крови (наиболее распространенной среди населения) здорового донора и лиофилизированных клеток пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S.I.Lesaffe, Франция).
Полученные из пальца капли крови (обычно 6-9 капель, первую каплю отбрасывали) сразу покапельно суспендировали в ЗФР в пенициллиновом флаконе для предотвращения свертывания крови. Эц промывали в ЗФР в центрифужных стеклянных градуированных на 10 мл пробирках (3 раза по 10 мл в расчете на 0,1 мл осевших клеток) центрифугированием в режиме оседания основной порции Эц (2,5 тыс об/мин, 12 мин) для удаления лейкоцитов и тромбоцитов (подбирается для конкретной центрифуги режим, когда виден еще слабый шлейф Эц над почти всеми осевшими Эц). Для повышения чувствительности эритроцитарной тест-системы клетки обрабатывали трипсином (кристаллическим трипсином фирмы SPOFA, Чехословакия). Трипсин растворяли в 1 мМ HCl (рН 3) в концентрации 10 мг/мл и добавляли в эппендорф с 10% (по объему) суспензией Эц до конечной концентрации 1 мг/мл. Трипсинизацию Эц проводили 30 мин при 37оС при периодичесаком перемешивании (каждые 10 мин). Избыток трипсина удаляли промыванием клеток центрифугированием (см. выше) в холодном ЗФР (трижды в 10 мл в расчете на 0,1 мл осевших клеток). Эц (нативные и трипсинизированные) в круглодонных лунках давали точку (2-4%-ные Эц в ЗФР) или небольшое кольцо (1-2%-ные Эц; спонтанная агглютинация менее 10%); отсутствовала спонтанная (50-100%-ная) агглютинация клеток, наблюдающаяся при избыточном действии трипсина на Эц. Клетки в ЗФР были стабильны (не гемолизировали) в течение 7-10 дней [результат отсутствия примесных лейкоцитов и тромбоцитов]. Перед употреблением суспензию Эц в рабочем разведении (2-4%-ном) дополнительно промывали ЗФР центрифугированием для удаления следов гемолиза. Максимальный гемолиз Эц человека обычно наблюдается в ЗФР при рН 7,0 , но полностью отсутствует при рН 7,4.
Дрожжевые лиофилизированные клетки инкубировали в ЗФР 2 ч при 37оС при перемешивании, затем трижды отмывали в ЗФР центрифугированием (2,5 тыс об/мин, 8 мин) и использовали 2-4%-ную суспензию дрожжей для тестирования фитолектинов.
Проведение цитоагглютинации в стриповом круглодонном полистироловом планшете (ВНИИ Мед Полимер, Москва).
[Попытки использовать плоскодонные полистироловые планшеты для ELISA не дали результатов).
Создавали серию 2-х (или 3-х, 5-ти) кратных разведений фракций экстракта в лунках стрипа с 25 мкл ЗФР (независимая от катионов металлов агглютинация) или с 25 мкл веронал-мединалового буфера с Са2+ и Mg2+ (10 мМ ВМБ2+, рН 7,4) для металлзависимой агглютинации. Фитолектин Con A (Sigma, grade IV, лиофилизированный, без солей, 1 мг/мл, в физиологическом растворе) служил контролем. Начальную желаемую концентрацию лектина или экстракта готовили в 1-й лунке (добавляли микролитры вещества к 100-200 мкл буфера, перемешивали и переносили аликвоту во 2-ю лунку с 25 мкл буфера; в 1-й лунке оставляли 25 мкл раствора). Для 2-кратной серии разведений перенос по 25 мкл в следующую лунку с 25 мкл буфера (из последней лунки отбрасывали 25 мкл); для 3,3-кратной серии перенос по 15 мкл в следующую лунку. К сериям разбавлений добавляли дозатором суспензии клеток (в ЗФР или ВМБ) так, чтобы конечная концентрация клеток составляла 1-2%. [объем капли Эц из пластмассового носика дозатора на 25-200 мкл составляет 21-22 мкл; капельный вариант максимально удобен для внесения клеток в центр лунок; для полного внесения 15 мкл клеток дозатором суспензию сорбировали на стенки лунок и затем объединяли клетки с содержимым дна лунок легкими ударами планшета в направлении верх-низ]. Картина оседания клеток в лунках видна через 20-30 мин в условиях комнатной температуры. Con A агглютинировал дрожжи при концентрации лектина 1 мкг/мл и ниже (требуется компьютерное редактирование картины невидимых визуально агглютинатов, см. ниже), а трипсинизированные Эц - при концентрации 5 мкг/мл. Чувствительность визуальной (не компьютерной) регистрации гемагглютинирующей активности (ГА) можно повысить в несколько раз (до 4-х раз) добавлением к Эц дрожжевых клеток.
ГА может быть выше при использовании смеси Эц с лейкоцитами (и тромбо-цитами) крови (см. выше), однако такие Эц менее стабильны (несколько дней) при хранении и более подвержены гемолизу. Удобно использовать трипсинизированные Эц с 50%-ной спонтанной (собственной) агглютинацией (благодаря гликофорину мембран Эц) без присутствия экзогенного лектина. Такие Эц очень чувствительны к низким концентрациям лектина (формируется круг 100%-ной ГА во всю лунку), можно оценить воздействие на гликофорин как гликопротеиновую мишень экзолектина (в том числе устранение экзолектином спонтанной ГА, например, за счет углеводной части экзолектина). Использование спонтанно (с постоянным выраженным диаметром кругов ГА в лунках) агглютинирующих Эц в качестве тест-системы для скрининга ингибиторов ГА практически не упоминается в литературе и является отличным резервом.
Модулирование цитоагглютинационной активности фракций I-III полисахаридами (Gal-PAA, ManP-PAA, Man-PAA и GlcNAc-PAA) [все синтетические гликополимеры получены от д.х. наук, зав. лаб. химии углеводов Бовина Н. В., Ин-та биоорганической химии РАН, Москва]
Использовали псевдоПС в концентрации 25 мкг/мл, в ВМБ(2+) рН 7,4 или ЗФР рН 7,4. В круглодонные лунки с серийными разбавлениями фитолектина (конечные объемы в лунках по 35 мкл) добавляли по 10 мкл ПС (конечная концентрация ПС в лунках – 5,5 мкг/мл). Перемешивали на “шейкере для планшетов ELISA” и инкубировали 10 мин при комнатной температуре (25оС). Добавляли во все лунки по центру по 20 мкл (1 каплю) суспензии клеток (конечная концентрация клеток в лунке – 1-2 объемных % ) так, что общий объем смеси в лунке – 65 мкл. Через 30 мин инкубации планшета при комнатной температуре проводили анализ картины ГА.
Регистрация цитоагглютинации.
Проводили фотографирование картины агглютинации в лунках планшета в камере BioChemi (UVP, Ca., США) в режиме живого изображения с последующей редакцией изображений с использованием компьютерной программы LabWorks54. Для оптимального фотографирования включали трансиллюминатор (254 нм, режим “low”), клали на него лист белой бумаги, ставили на бумагу стеклянную полочку (стеклянный кристаллизатор высотой 20 см), на которую помещали планшет [планшет на самом трансиллюминаторе дал отрицательные результаты: нет равномерного распределения ссвета, ухудшение картин РАА и агглютинации цветными примесями, отсутствие четкости, ложная интерпретация ГА; положительный результат – проявление агглютинации бесцветных клеток – дрожжей). Центрировали планшет, вручную подбирали удобную яркость изображения, наводили на планшет фокус. Времена экспозиции обычно составляли 0,02-0,05 сек (выставляются на дисплее компьютера). В случае бесцветных (в отличие от Эц) дрожжей компьютерное редактироование картины (поиск оптимального соотношения яркости, контрастности и нелинейной гамма-коррекции) позволяло не только получить и значительно улучшить изображение агглютинатов дрожжей, но и точно определить титр агглютинации фитолектином .
Результаты очистки и тестирования фитолектинов.
Формирование осадка (ночь, 40 С) было во всех экстрактах (кроме ХК), а его количество снижалось в ряду ИЧ > ФГ > Ч > Ф2. Осадок растворялся в воде практически полностью (при этом могло наблюдаться пенообразование, характерное, например, для белков).
Все фитолектины обнаруживались только в фракции II (для ФГ- во фракции I).
Нигде не выявлялись гемолизины по данным картины гемагглютинации, в том числе при хранении планшета с картиной гемагглютинации в течение недели при 40 С.
Картины цитоагглютинации в планшете были устойчивы неделю при 40 С (агглютинаты не рассасывались).
Характер цитоагглютинации в планшете в столбцах с серийными разбавлениями фракций (максимальные концентрации фитолектинов в первых ленках) позволял анализировать сразу три активности: лектиновую (классическую дозозависимую) – белковой/гликопротеиновой/белок-полисахаридной природы, рассасывающую агглютинаты (РАА) – ферментативной природы и агглютинирующую цветными примесями (желтыми или темнокоричневыми) – не белковой природы.
Фитолектиновая классическая активность обнаруживались особенно хорошо в случае ИЧ (распределение по всем фракциям), ЧВ (в II и III), Ф2 (в I и II) и ФГ (в II и III). Агглютинация Эц не выявлялась в случае ХК (ГА менее 15% в 1-й лунке в случае фракции II ). Гемагглютинирующая активность (ГА) была слабо выражена в случае Ч (только во фракции II, в 1-й лунке и лишь 15% от 100%-ной агглютинации). ФГ-II агглютинировали дрожжи лучше, чем трипсинизированные Эц А(II)(+)-группы крови человека.
При сравнительной оценки ГА фракции II фитокомпозиций. видно, что максимальная фитолектиновая активность присутствует в Чаговите и Фитокомпозиции N 2 (табл. 1).
Табл.1.  Сравнительная оценка ГА фитокомпозиций (фракции II); в расчете на 1 г сырья.

В различных фракциях выявлялась РАА с лектиноподобными свойствами (все случаи появления ГА через максимум, т.е. когда в первых лунках нет ГА из-за ее рассасывания, затем ГА появляется, ее степень положительно зависит от полисахаридного ингибитора ферментов углеводного обмена, преимущественно, гликозидаз; после появления ГА следует дозозависимое классическое снижение ГА, как для лектинов). Cильно выраженная РАА: ХК-I-II(минимум ГА во 2-й лунке; максимум ГА в 3-й лунке для ХК-I и, вероятно, в 4-й лунке для ХК-II), ФГ-I, ЧВ-I, Ф2-III. Происходит очистка фитолектинов от РАА в случае Ф2-II и, частично, ФГ и ЧВ. Резервы изучения РАА: а) можно ожидать появление ГА при более высоких разбавлениях препаратов, б) возможны несколько максимумов ГА из-за присутствиия нескольких различающихся инициаторов РАА.
Распределение агглютинации цветными примесями для ЧВ было III>II>>I, для ИЧ – III>I, для Ч и ФГ – только в I или III, соответственно; для Ф2 – II>I>>III. Агглютинация цветными примесями (контурная не красного цвета ГА вокруг ГА лектинового типа): желтый контур в лунках 1 и 2 для фракции III фитогора; темно-коричневая ГА сплошная (в 1-й лунке ИЧ-I, III; ЧВ-III) или контурная (ФГ-III-лунки 1,2; ИЧ-III-лунки 2,3; ЧВ-I-лунка 1; ЧВ-II-лунки 2,3: ЧВ-III-лунки 2,3; Ч-I-лунки 1,2; Ф2-I-II-лунки 2,3; Ф2-III-лунка 1).
Влияние синтетических псевдополисахаридов на цитоагглютинирующую активность агглютининов (фитолектинов и других) [все три синтетические гликополимеры получены от д.х.наук, зав. лаб. химии углеводов Бовина Н. В., Ин-т биоорганической химии РАН, Москва]

В случае Ф2-I (I свободна от цветных примесей) в первых трех лунках наблюдалась отчетливое ингибирование ГА посредством бета-галактановых и хитиновых аналогов ПС (Gal-PAA > GlcNAc-PAA.
В случае Ф2-II (есть цветные примесные агглютинины) и ФГ-II (нет цветных примесных агглютининов) ингибирование контрольной спонтанной ГА (присутствие лишь следовых количеств агглютининов – белковых фитолектинов в лунках) в лунках 3 и 4 (нет цветных агглютининов) снижалось в ряду полисахаридов: ManP-PAA > Man-PAA >GlcNAc-PAA.; в то же время во вторых лунках (с цветными агглютининами) Ф2-II маннан и фосфоманнан стабилизируют/активируют ГА, подобно активации агглютинации дрожжей посредством Con A (ManP-PAA > Man-PAA > GlcNAc-PAA). По-видимому, тестированные ПС не влияют на цветные агглютинины, а действуют на активность классических (глико)протеиновых фитолектинов и РАА. Однако на фотографиях контуры цветной агглютинации могут мешать анализу картины истинной фитолектиновой ГА.
Наблюдалось отчетливое ингибирование ГА фитолектина ИЧ-II (нет примесных цветных агглютининов) в третьих лунках и, слабее, вторых лунках посредством хитиноподобного GlcNAc-PAA > Gal-PAA. Ингибирование фитолектина ЧВ-II во вторых лунках: хитинподобный GlcNAc-PAA > Gal-PAA.
Выводы
Таким образом, в Ф2-II содержится значительное количество лектина, сходного с Con A по альфа-маннан-специфичности. В ИЧ-II содержится фитолектин, специфичный к хитину/хитозану/ олигомерам N-ацетилглюкозамина (похожий на лектины WGA, STA, LEA). Полученные результаты косвенно могут служить критерием для оценки имеющихся и создания новых фитолектиновых комплексных препаратов.

Литература

Корсун В.Ф., Римша В.М., Бореко Е.И. Противовирусные свойства растительных лектинов// Тез. докл. Пятого Росс. съезда врачей-инфекционистов. – М., 1998. –С.265-266.
Корсун В.Ф., Римша В.М., Бореко Е. И.,Никулина Е.В. Растительные лектины – новые аспекты фитофармакологии инфекционно- воспалительных процессов // - Матер. конф. «Патофизиология и современная терапия» М.,2000. С.102 – 104.
Корсун Е.В. Обоснование возможности применения растительных лектинов при некоторых вирусных инфекциях: Дисс. канд. мед. наук. – М., 2004.
Журн. «Практическая фитотерапия», 2004, № 3. с.10 – 17.